滁菊多酚氧化酶的三相分离及其酶学特性分析

苗文娟，陈 强，曾 妍，朱双杰，董艺凝

(滁州学院生物与食品工程学院，滁州 239000)

滁菊又名“甘菊”、“白菊”，位列中国“四大药菊”之一[1-2]。因富含多酚以及黄酮类活性成分[3-5]，新鲜滁菊在采收、加工及贮藏过程中均易发生褐变，严重影响产品价值。有研究表明，多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）和过氧化物酶（Peroxidase,POD）是引起菊花褐变的关键酶[6]，PPO 催化植物体内的酚类底物氧化成醌，醌类物质再相互聚合形成褐色化合物，导致植物组织褐变[7-8]。朱玉芸[6]对亳菊的酶促褐变相关酶及其品质影响进行了研究，其结果表明酶促褐变导致亳菊酚酸类物质含量显著下降，降低了亳菊的抗氧化性，影响了亳菊的药效和品质。目前，尚无研究者开展关于滁菊酶促褐变的相关研究。

在酶的分离纯化方面，多采用盐析、离子交换色谱以及凝胶过滤色谱等分离纯化手段[9-11]。但由于这些方法在操作过程中涉及操作周期长、提取率低、性能设备要求高等缺点，近年来，有一些新型分离纯化方法，如双水相萃取法、三相分离法等开始应用于酶的分离纯化[12-14]。三相分离法通过在提取液中加入无机盐和有机溶剂，可以选择性地将需要的酶分配到其中一相，蛋白质和油脂等其他杂质分配到其他相中，从而实现酶的纯化目的[15-16]。三相分离是一种简单、快速和易于放大的分离纯化酶的方法，不需要硫酸铵盐析时的多次分级沉淀[16]，也比柱层析法更加经济绿色环保。罗磊等[17]使用三相分离法对金银花POD 进行了分离纯化，发现经三相分离后金银花POD 纯化倍数达到5.849；Vetal等[18]的研究表明三相分离法是一种提取和部分纯化桔皮POD 的理想方法；Gagaoua 等[19]采用三相分离法从无花果树中纯化蛋白酶，其研究表明三相分离法是一种简单、经济、快捷的纯化蛋白酶的方法。但目前尚鲜见关于利用三相法分离纯化滁菊PPO的研究报道。鉴于此，本研究采用三相分离法纯化滁菊PPO，并对其酶学特性进行分析，以期为滁菊采后褐变的控制提供一些理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滁菊，2019 年10 月采自滁州市金玉滁菊生态科技有限公司种植基地；邻苯二酚（化学纯），南京化学试剂股份有限公司；考马斯亮蓝G250，牛血清白蛋白，国药集团化学试剂有限公司；硫酸、氨水、叔丁醇，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；硫酸铵，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

L3S 型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；BSA124S-CW 型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；超声波清洗器，宁波海曙科生超声设备有限公司；HHS 型恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司；TGL-16M 型高速台式冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PHS-3C 型pH 计，上海越平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 滁菊PPO粗酶液的提取 称取新鲜滁菊10 g置于研钵中，加入20 mL 预冷的0.1 mol·L-1，pH 6.5的磷酸盐缓冲液，快速研磨后用绢布过滤，滤渣重新加入pH 6.5 磷酸盐缓冲液重复上述操作，合并2次滤液于4 ℃、9 000 r·min-1条件下离心15 min，上清液转入100 mL 容量瓶并定容，分析粗酶液中PPO 酶活性和蛋白质含量。

1.3.2 滁菊PPO 三相分离纯化 参照 Gagaoua[19]与罗磊[17]等的方法进行三相分离纯化并稍作修改。取一定体积滁菊PPO 粗酶液至50 mL 离心管中，加入一定量的硫酸铵，快速涡旋振荡溶解，调节溶液至一定pH 值，然后按照一定体积比加入叔丁醇，涡旋混合后室温静置一定时间，4 000 r·min-1离心10 min 以促进三相分离。吸除上层有机相和下层水相，中间沉淀层用0.1 mol·L-1、pH 6.5 的磷酸盐缓冲液溶解，透析除盐后定容至10 mL，对其酶活和蛋白质含量进行测定。分别考察三相分离纯化体系的硫酸铵添加量、pH 值和提取液与叔丁醇的体积比和三相分离时间对滁菊PPO 纯化效果的影响。

（1）pH 值。取10 mL 滁菊PPO 粗酶液，添加3.0 g 硫酸铵，固定提取液与叔丁醇的体积比为1:1，三相分离静置时间1 h，考察三相分离pH 值（pH 3 ～ 8）对滁菊PPO 回收率和纯化倍数的影响。

（2）硫酸铵添加量。在最优的pH 条件下，固定提取液与叔丁醇的体积比为1:1，三相分离静置时间1 h，考察硫酸铵的添加量（0.20 ～ 0.60 g·mL-1）对滁菊PPO 回收率和纯化倍数的影响。

（3）体积比。在最优pH 值及硫酸铵添加量条件下，考察提取液与叔丁醇的体积比（1:0.5、1:1、1:1.5、1:2 和1: 2.5）对滁菊PPO 回收率和纯化倍数的影响。

（4）三相分离时间。在最优pH 值、硫酸铵添加量和提取液与叔丁醇的体积比条件下，考察三相分离时间（5 ～ 80 min）对滁菊PPO 回收率和纯化倍数的影响。

1.3.3 滁菊PPO 酶活测定 参照何军忠等[20]的方法并加以修改：取2.0 mL 磷酸盐缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 6.5）于比色皿中，加入0.3 mL 邻苯二酚底物溶液（0.35 mol·L-1），加入0.2 mL PPO 酶提取液后迅速混匀，立即放入分光光度计于420 nm 处测定吸光值（动力学测量模式），从0 s 开始每20 s读数1 次，计时1 min。每组平行测定3 次并作空白对照。滁菊PPO 酶活力定义为：每分钟每克滁菊鲜样吸光值增加0.01 为一个酶活力单位（U·g-1）。

1.3.4 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝G 250比色法测定滁菊PPO 粗酶提取液和纯化后样品中蛋白质含量，并计算纯化前后滁菊PPO 酶的比活力、纯化倍数和回收率。

1.3.5 滁菊PPO 酶学特性分析 （1）pH 对滁菊PPO 活性的影响：配制0.1mol·L-1、pH 4.0 ～ 9.5 范围内的磷酸盐缓冲液，按照1.3.3 的方法测定PPO活力，考察pH 对滁菊PPO 活性的影响。

（2）温度对滁菊PPO 活性的影响：取适量磷酸盐缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 6.5）和邻苯二酚溶液（0.35 mol·L-1）分别置于试管中，在20 ～ 70℃下水浴保温，迅速转移到比色皿中混合均匀，立即加入0.2 mL 粗酶提取液，按照1.3.3 方法测定PPO 活力，考察温度对滁菊PPO 活性的影响。

（3）底物浓度对滁菊PPO 活性影响：在最适pH 值条件下，分别以不同浓度的邻苯二酚（0.10～0.50 mol·L-1）作为底物，按照1.3.3 方法测定PPO活力，考察底物浓度对滁菊PPO 活性的影响。根据Lineweaver-Burk 作图法计算米氏常数和最大酶促反应速率。

（4）滁菊PPO 的热稳定性：将滁菊PPO 粗酶液分别在50、60 和70 ℃水浴中保温1～ 25 min 后取出，待粗酶液冷却至25 ℃后，按照1.3.3 方法测定滁菊PPO 活力，以25 ℃所测酶活力为100%，考察温度和保温时间对滁菊PPO 活性的影响。

1.3.6 数据处理 所有试验数据均重复3 次，采用Excel 2007软件进行数据处理，Origin 2019软件绘图。

2 结果与分析

2.1 pH 值对滁菊PPO 纯化效果的影响

pH 值是三相分离纯化过程的一个重要参数[15]，蛋白质盐析的效率取决于反应体系中蛋白质所带的净电荷，而净电荷高度依赖pH 值，因此实验研究了pH 值对滁菊PPO 三相分离纯化效果的影响。由图1 可以看出，在实验设置的pH 梯度中，PPO 酶活回收率和纯化倍数整体呈现先上升后下降的趋势。pH 值在3 ～ 6 时，滁菊PPO 酶活回收率和纯化倍数均呈上升趋势，且在pH 值等于6 时，酶活回收率和纯化倍数达到最大，达到最佳纯化效果。

图1 pH 值对滁菊PPO 纯化效果的影响Figure 1 Effect of pH on purification effect of Chuju PPO

2.2 硫酸铵质量浓度对滁菊PPO 纯化效果的影响

硫酸铵浓度在三相分离纯化过程起着重要作用[21-22]，因为蛋白质的溶解度受到溶液离子强度的影响，在较高的盐浓度下，水分子受到盐离子的吸引，导致蛋白质与蛋白质间相互聚集沉淀。在PPO粗酶液与叔丁醇的体积比为1:1 时，考察硫酸铵的添加量（0.20 ～ 0.60 g·mL-1）对滁菊PPO 回收率和纯化倍数的影响。由图2 可见，滁菊PPO 的酶活回收率和纯化倍数随着硫酸铵质量浓度的增加整体呈现先上升后下降的趋势，硫酸铵浓度在0.40 g·mL-1时，酶活回收率和纯化倍数达到最大值。随着硫酸铵质量浓度进一步增加，酶蛋白的纯化效果反而降低，这可能是因为随着硫酸铵质量浓度增大，过高的离子强度会结合大量的水分子，产生强烈的盐析效应，使杂蛋白疏水沉淀[17,23]。因此，以质量浓度0.40 g·mL-1的硫酸铵进行滁菊PPO 纯化最佳。

图2 硫酸铵质量浓度对滁菊PPO 纯化效果的影响Figure 2 Effect of ammonium sulfate concentration on the purification effect of Chuju PPO

图3 提取液与叔丁醇体积比对滁菊PPO 纯化效果的影响Figure 3 Effect of the volume ratio of extract to t-butanol on the purification of Chuju PPO

2.3 提取液与叔丁醇体积比对滁菊PPO纯化效果的影响

由于叔丁醇具有合适的分子大小和支链结构，因此它不容易渗透到蛋白质分子内部而引起蛋白质变性，多篇文献报道了叔丁醇是三相分离纯化的最佳有机溶剂[24-25]。叔丁醇作为一种常见的有机溶剂，与硫酸铵一起相互增强离子强度、渗透压和排它效应等物理化学效应，使蛋白质作为中间层在水相和有机相之间分配[26]。因此，本试验以叔丁醇作为三相分离纯化的有机相，考察提取液与叔丁醇的体积比（1: 0.5、1:1、1:1.5、1:2 和1:2.5）对滁菊PPO回收率和纯化倍数的影响。

由图3 可知，滁菊PPO 酶活回收率和纯化倍数随着叔丁醇和提取液体积比的提高先上升后下降，当提取液与叔丁醇体积比为1:1.5 时，滁菊PPO 酶活回收率和纯化倍数最高。这可能是因为随着叔丁醇加入量的提高，可以从水相中吸收更多的水，从而导致水相中硫酸铵盐浓度增加，提高蛋白质在两相界面处的分离，当达到合适的体积比时，蛋白质回收率和纯化倍数都达到最大；当叔丁醇加入量过多时，提取液介电常数降低导致杂蛋白也沉淀，同时过量的叔丁醇破坏了蛋白质表面的水化层结构，部分酶变性失活，纯化效果降低。所以酶蛋白纯化效果随着提取液与叔丁醇体积比增大先上升后下降。

因此，采用三相法提取滁菊PPO 时，使用的叔丁醇体积应是酶粗提液的1.5 倍，在此条件下滁菊PPO 能够达到最佳纯化效果。

2.4 三相分离时间对滁菊PPO 纯化效果的影响

在加入叔丁醇后，体系会形成三相，但中间沉淀层富含蛋白容易发生乳化现象。现考察三相分离的静置时间对滁菊PPO 纯化效果的影响，结果（表1）表明，三相分离过程中静置时间对滁菊PPO 回收率和纯化倍数没有促进作用，经静置5 ～ 80 min后离心，中间相均可形成一层薄薄的蛋白沉淀层，经回收后测定其酶活回收率在79.2% ～ 87.7%之间，纯化倍数在3.1 ～ 4.2 倍之间。由此可见，在三相分离纯化蛋白质过程中，在加入叔丁醇混匀后即开始离心分离，可以缩短三相分离的时间。

表1 三相分离时间对滁菊PPO 纯化效果的影响Table 1 Effect of three-phase separation time on the purification of Chuju PPO

综上，从回收率和纯化倍数两个方面对滁菊PPO 的三相分离条件进行了分析，结果表明在三相分离过程中，硫酸铵浓度、pH、提取液和叔丁醇的体积比均对三相分离的结果有影响，三相分离静置时间对其影响不大。经三相分离后，滁菊PPO 酶的平均纯化倍数达到4.3 倍。王剑锋等[27]采用三相分离和凝胶色谱对α-半乳糖苷酶进行纯化，其结果显示α-半乳糖苷酶经三相分离后纯化倍数达到21.6，经Sephadex G-100 凝胶过滤色谱分离后纯化倍数达到54.8，但经凝胶过滤色谱分离后回收率仅为27.3%；Nkya 等[9]对菊科植物茼蒿(Chrysanthemum coronariumL.)中的PPO 进行了分离纯化，采用硫酸铵分级分离、离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤色谱分离后，茼蒿PPO 的纯化倍数为32，回收率为16%。由此可见三相分离对酶的纯化属于初级纯化，纯化倍数不高，但该法回收率高，具有经济、快速的优点，可以大规模使用。

2.5 滁菊PPO 酶学特性分析

2.5.1 pH 值对滁菊PPO 活性的影响 由图4 可见，滁菊PPO 对pH 值的变化较敏感，在实验分析的pH值5.0 ～ 9.0范围内，滁菊PPO 的活性先增大后减小，pH 值为6.5 时，滁菊PPO 活性最强。当pH＞7 以后，滁菊PPO 酶活显著下降；在pH 9.0 时，滁菊PPO 的残存酶活降低至24%。由此可见，当以邻苯二酚为底物时，其反应的最适pH 值为6.5，与红果枸杞PPO[28]最适pH 值一致。葡萄[29]PPO 的最适pH值为5.0，亳菊[6]和八角莲[20]PPO 的最适pH 值均为7.0，说明不同来源的原材料的最适反应pH 有较大差异，根据滁菊PPO 的性质特点，可以加入抗坏血酸等有机酸抑制PPO 引起的酶促褐变。

图4 pH 值对滁菊PPO 酶活性的影响Figure 4 Effect of pH on enzyme activity of Chuju PPO

2.5.2 温度对滁菊PPO 活性的影响 由图5 可知，在实验设置的温度范围内（20 ～ 80 ℃），滁菊PPO活力总体呈先上升后下降的趋势。在30 ℃时酶活最大，为787 U·g-1；当温度高于30 ℃时，酶活开始下降，当反应温度为80 ℃时，滁菊PPO 活性仅为30 ℃时的18.96%。出现这种趋势的原因是因为温度对酶的双重作用，适当的升温使分子间运动加剧，加快反应速率，促进酶促反应，但温度过高会使酶活性部位构象变化从而导致蛋白质变性失活。因此，滁菊PPO 的最适反应温度是30 ℃，与八角莲PPO[20]等一致，与红果枸杞[28]（36 ～ 40 ℃）、水蜜桃[30]（40 ℃）、莲子[31]（20 ℃）等最适反应温度有一定差异。

图5 温度对滁菊PPO 酶活性的影响Figure 5 Effect of temperature on enzyme activity of Chuju PPO

2.5.3 底物浓度对滁菊PPO 的影响 PPO 酶促褐变形成的物质基础有底物（酚类）、酶蛋白和氧气。多项研究表明，邻苯二酚是PPO 的最适底物。在本试验中，研究了邻苯二酚底物浓度变化对滁菊PPO活性的影响。由图6 可知，当滁菊PPO 浓度一定时，底物浓度小于0.35 mol·L-1时，PPO 催化酶活随着底物浓度的增加而升高，反应速率与底物浓度正相关；当浓度高于0.35 mol·L-1，PPO 活性不增加反而有缓慢降低的趋势。其原因可能是当底物浓度较低时，酶蛋白只有其中的一小部分参加酶促反应，随着底物浓度的增加，酶与底物的结合率提高；在底物浓度达到一定值后，所有酶分子的活性部位都与底物结合，此时酶分子被底物饱和，继续增加底物浓度也不能提高酶的活性，这时的反应速率达到最大值。

图6 底物浓度对滁菊PPO 活性的影响Figure 6 Effect of substrate concentration on enzyme activity of Chuju PPO

依据Lineweaver-Burk 双倒数方程，对滁菊PPO反应初速度和酶活性用双倒数作图法作图，可以得到一拟合曲线（图7）。由图7 可知，以邻苯二酚作为滁菊PPO 的反应底物时，其反应符合米氏方程，根据图中直线斜率和纵轴截距，求得底物的Km和酶的最大反应速率Vmax分别为0.174 9 mol·L-1和961.538 5 U·min-1。

图7 以邻苯二酚为底物时双倒数曲线Figure 7 Lineweaver-Burk curve of PPO using catechol as the substrate

图8 滁菊PPO 的热稳定性Figure 8 Thermal stability of Chuju PPO

2.5.4 滁菊PPO 的热稳定性 实验分别测定了在50 ～ 70 ℃条件下处理1 ～ 25 min 后滁菊PPO 的热稳定性。由图8 可知，在各加热温度下，随着加热时间的延长，滁菊PPO 活性均呈现降低趋势。相对于60 和70 ℃，滁菊PPO 在50 ℃时较为稳定，该温度下加热25 min 仍能保持30.93%的酶活力；同样加热25 min，60 和70 ℃的滁菊PPO 相对活力分别为15.99%和4.54%；在70 ℃加热条件下滁菊PPO活性显著减小，在70 ℃条件下加热3 min，酶活力仅剩25%，加热10 min，酶活力仅剩7.29%。该结果为滁菊褐变的抑制提供了理论依据，在滁菊采收后可以用高于60 ℃的温度对滁菊进行杀青处理，此时滁菊PPO 的活性会显著下降，从而达到减轻褐变的目的。

3 结论

三相分离法是一种从粗酶提取液中直接分离目标蛋白酶的有效方法。以酶活回收率和纯化倍数为评价指标，探究三相分离过程中不同pH、硫酸铵质量浓度、提取液与叔丁醇的体积比等因素对滁菊PPO 纯化效果的影响。三相分离纯化滁菊PPO 的较优工艺参数为：硫酸铵质量浓度0.40 g·mL-1，pH 值6.0，粗提液与叔丁醇的体积比为1:1.5。在优化工艺条件下，滁菊PPO 酶的纯化倍数为4.3，酶活回收率为83.2%。从酶的热稳定性等方面对滁菊PPO 酶学特性进行研究，结果表明，以邻苯二酚为底物，其反应的最适pH值为6.50，最适反应温度为30 ℃，底物最适浓度为0.35 mol·L-1，底物Km和Vmax分别为0.174 9 mol·L-1和961.538 5 U·min-1。滁菊PPO对pH 值和温度的变化都比较敏感，在pH 值为9的条件下残存酶活仅剩24%；70 ℃加热3 min，残存酶活仅剩25%，加热10 min 残存酶活仅剩7.29%。