大白菜木质素含量测定方法的建立

孙 笑 李国亮 李 菲 章时蕃 张 慧 戴 昀 孙日飞 张淑江

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕起源于中国，是种植范围广、年消费量最高的十字花科蔬菜之一。随着消费水平的不断提高以及蔬菜品种的多样化，人们对大白菜品质的要求越来越高，这对大白菜育种研究提出了更高的要求。

木质素（lignin）是由3 种醇单体（对香豆醇、松柏醇、芥子醇）聚合而成的一种复杂酚类聚合物，结构比较稳定，它是构成木本植物、草本植物骨架的主要成分之一。其化学成分主要有3种单体类型：由对羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对羟基苯基木质素（para-hydroxy-phenyl lignin，H 型），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素（guaiacyl lignin，G 型）和由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素（syringyl lignin，S型）（Barros et al.，2015）。木质素是植物细胞中由苯丙氨酸/酪氨酸代谢途径产生的重要的次级代谢产物之一，是世界上第二大生物聚合物，大约占生物圈中有机碳含量的30%（Liu et al.，2018）。木质素通过作用于细胞壁来调控细胞生长发育，维持植株的机械强度，保证植株物质运输能力，增强抗逆性（Zhao et al.，2020）；同时，其含量增加可显著提高离子活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、酪氨酸解氨酶（TAL）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性（Lee et al.，2018）。木质素是膳食纤维的重要组成部分，相对于纤维素，木质素对蔬菜品质的影响更大，木质素含量增加会导致细胞壁加厚，植物组织木质化，进而影响蔬菜产品品质（Thimm et al.，2002；Jia et al.，2015）。

目前对植物中木质素含量的测定方法已有较广泛的研究，基本原理主要是基于称量或光谱学（Fache et al.，2016）：利用木质素中的酚羟基发生乙酰化，通过测定乙酰化木质素溶液在280 nm 处的最大紫外吸光值定量判断木质素的含量（Hatfield et al.，1999；Chang et al.，2008；Fukushima et al.，2015；Weijde et al.，2016）；采用72%浓硫酸水解纤维素和半纤维素，称量不溶于酸的木质素的Klason 法（陈为健 等，2002；周强 等，2016）；利用木质素能够溶解于碱液的原理，对木质素进行定量测定的碱法（曾汉元 等，2012；Chen et al.，2018）；采用“相似相溶”原理，使木质素溶解到有机溶剂中，对木质素进行定量测定的溶剂法（黄娇 等，2009；王东玲 等，2020）；依据朗伯-比尔定律的红外光谱定量分析木质素含量的近红外光谱法（Yamada et al.，2006；Tamaki &Mazza，2011；Derkacheva &Tsypkin，2018）等。其中，应用比较广泛的是利用木质素中的酚羟基可以在乙酰溴-冰醋酸溶液中发生乙酰化并形成乙酰化木质素，且反应体系的紫外吸光值与木质素中的酚羟基间存在定量的反应关系，同时在该反应体系中加入高氯酸可促进样品包括纤维素部分的细胞壁溶解，提高测定的准确度（Hatfield et al.，1999；Chang et al.，2008；Fukushima et al.，2015）。本试验基于前人的研究结果，利用木质素乙酰化后在280 nm 处具有吸收峰值的特性，建立并优化了大白菜木质素含量的测定方法，以期为大白菜品质育种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试大白菜材料共14 份，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所大白菜育种课题组提供，涉及早、中、晚熟类型，能够保证测定方法的高适用性。2019年8 月26 日定植于本所顺义杨镇试验基地，大田常规生产管理，每畦2 行，株行距均为35 cm，每份材料种植30 株。10 月20 日成熟期取样，测定木质素含量。

试验试剂：木质素标准品（纯度为90%，北京索莱宝科技有限公司）、乙酰溴（Sigma-Alorich）、高氯酸（天津市风船化学试剂科技有限公司）、冰醋酸（上海麦克林生化科技有限公司），木质素测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），所用试剂皆为分析纯。

试验仪器：鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）、紫外分光光度计（UV-2500）、电子天平（TB-114）、水浴锅（上海博讯医疗设备厂）、干燥柜（HZDs-160011）、Retsch MM400 球型研磨仪〔弗尔德（上海）仪器设备有限公司〕。

1.2 取样方法

每份材料随机选取3 个结球紧实的大白菜茎球部（去掉外叶后的功能叶片），采用四分法混样并人工粉碎，然后取300 g 置于65 ℃烘干箱中烘干至恒重，利用球型研磨仪（25 Hz、10 s）研磨成80 目以上的干粉并编号，置于25 ℃、湿度为10%的干燥柜中保存。

1.3 试验设计

采用四因素三水平正交试验设计，按L9（34）正交表（表1）设置9 个处理（表2），比较各因素水平对大白菜木质素含量测定结果的影响，每处理3 次重复。

表1 L9（34）正交试验因素水平表

以大白菜7 号材料为试材，准确称取5.0 mg置于50 mL 具塞试管中，依次加入乙酰溴浓度为10%～30%的冰醋酸溶液5 mL 和70%高氯酸溶液0.5 mL，盖好试管塞，在50～70 ℃恒温水浴下反应15～35 min，每隔10 min 取出振荡，然后自然冷却。将反应液移入装有2 mol·L-1氢氧化钠溶液10 mL+冰醋酸溶液10 mL 的容量瓶中终止反应，充分混匀后取1.5 mL，8 000 r·min-1离心5 min。以冰醋酸为空白溶液，取离心后的上清液1 mL，采用1 mL 石英比色皿测定不同反应条件下产物在280 nm 处的紫外吸光值。0～60 min 内，每隔20 min 重复测定紫外吸光值。

1.4 正交试验的验证及反应条件的优化

根据正交试验所得最优组合进行梯度试验，对4 个因素进行单因素验证与优化，筛选测定大白菜木质素含量的最佳反应条件。乙酰溴浓度梯度设置为0、10%、20%、30%、40%、50%，反应温度梯度设置为40、50、60、70、80 ℃，反应时间梯度设置为0、10、20、30、40、50、60、70 min。参试材料及测定方法同1.3。

使用木质素测定试剂盒对14 份大白菜材料进行木质素含量测定，并与优化后比色法的测定结果进行差异性分析。

1.5 标准曲线的制作

取木质素标准品，配制成浓度分别为0.005 0、0.010 0、0.015 0、0.020 0、0.025 0、0.030 0、0.035 0 mg·mL-1的木质素标准液，70 ℃恒温水浴35 min，每隔10 min 取出振荡，然后自然冷却；将反应液移入装有2 mol·L-1氢氧化钠溶液10 mL+冰醋酸溶液10 mL 的容量瓶中终止反应，充分混匀后取1.5 mL，8 000 r·min-1离心5 min，测定280 nm处的紫外吸收值，得到木质素标准工作曲线。

1.6 精确度及空白加标回收率

取木质素标准品，配制浓度为0.010 0 mg·mL-1的木质素标准液，采用优化后的比色法连续测定11 次，计算相对标准偏差（RSD），检验该方法的精确度。

取浓度为50 mg·mL-1的木质素标准品0.1 mL，以空白溶液为对照，采用优化后的比色法平行测定6 次，计算空白加标回收率。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

由表2 可知，A 因素（乙酰溴浓度）各水平间极差最大，其次是B 因素（反应时间）和C 因素（反应温度），D 因素（体系稳定时间）对木质素含量测定结果的影响最小；最优组合为A3B3C3D1，即乙酰溴浓度为30%，反应时间为35 min，反应温度为70 ℃，体系稳定时间为20 min。

表2 正交试验设计的因素和水平及极差分析

2.2 乙酰溴浓度的优化

乙酰溴的浓度是决定木质素乙酰化程度的重要因素。依据正交试验结果及王建庆等（2013）的方法，选择70 ℃、35 min 为反应条件。如图1 所示，随着乙酰溴浓度的提高，试样中木质素乙酰化的程度增加，紫外吸光值亦增大，当乙酰溴的浓度超过30%以后紫外吸光值趋于稳定，因此判断30%的乙酰溴浓度下木质素乙酰化程度最为高效。

2.3 反应温度的优化

反应温度也是木质素乙酰化过程中的重要影响因素，高温会促进木聚糖的分解，导致紫外吸光值增大（Hatfield et al.，1999）；但反应体系温度超过乙酰溴的沸点（75～77 ℃）会使溶液迸溅，增加试验的危险系数；同时还会使乙酰溴与冰醋酸的挥发量增大，导致乙酰溴-冰醋酸介质浓度降低（王建庆 等，2013），进而导致试样的乙酰化程度降低，紫外吸光值亦降低。如图2 所示，选择30%乙酰溴、35 min 为反应条件，随着温度的升高紫外吸光值增加，当温度超过70 ℃后试样的紫外吸光值不再产生明显变化，因此确定70 ℃为最佳反应温度。

2.4 反应时间的优化

选择30%乙酰溴、70 ℃为反应条件，筛选最佳反应时间。如图3 所示，0～20 min 反应阶段，试样的紫外吸光值迅速增大，该反应时段木质素的溶解率最高；当反应进行到40 min 后，试样的紫外吸光值趋于稳定。结合正交试验结果，判定40 min 为最佳反应时间。

同时，对反应体系溶液进行稳定性检验。如图4 所示，该溶液反应体系较为稳定，0～70 min 内紫外吸光值无明显波动。与正交试验结果一致，该因素对木质素含量测定结果的影响最小，在70 min内及时测定，试样的紫外吸光值稳定，均可以满足试验分析要求。

2.5 两种方法测定结果比较

分别采用优化后的比色法（乙酰溴浓度为30%，反应温度70 ℃，反应时间40 min）和木质素测定试剂盒对14 份大白菜材料的木质素含量进行测定，结果如表3 所示，同一试样采用两种方法测定的数值无较大差异。进一步进行差异性分析（表4），F值＜F临界值，且P值＞0.05，说明这两种方法所测数值基本一致，差异不显著。由此可验证，优化后的比色法准确度较高，符合试验分析要求。

表3 两种方法对14 份大白菜材料木质素含量的测定结果

表4 差异性分析结果

从表3 还可以看出，采用优化后的比色法进行测定，参试14 份大白菜材料木质素含量的平均水平为429.27 mg·g-1，变化范围为207.78～754.18 mg·g-1。说明运用比色法可以准确检测出不同大白菜材料间木质素含量的差异，也反映出比色法灵敏度较高。

2.6 标准工作曲线

按浓度梯度0.005 0、0.010 0、0.015 0、0.020 0、0.025 0、0.030 0、0.035 0 mg·mL-1配制木质素标准液，采用优化后的比色法测定280 nm 处的紫外吸收值，得到木质素标准工作曲线（图5），其线性方程为y=22.879x-0.002 4，相关系数R2= 0.994 7。

2.7 精确度及空白加标回收率

配制浓度为0.010 0 mg·mL-1的木质素标准液，采用优化后的比色法连续测定11 次，相对标准偏差RSD=0.3%，表明该优化方法准确可靠，精确度较高。

取浓度为50 mg·mL-1的木质素标准品0.1 mL，以空白溶液为对照，采用优化后的比色法平行测定6 次，空白加标回收率在97.3%～101.8%之间（表5），可以满足试验分析要求。

表5 空白加标回收率试验结果

3 结论与讨论

本试验结果表明，在乙酰溴浓度为30%、反应温度70 ℃、反应时间40 min，加入高氯酸0.5 mL的条件下可以快速、准确测定大白菜中木质素的含量。

虽然关于木质素含量的测定方法已有较多研究，陈为健等（2002）利用Klason 法对花生壳中的木质素含量进行定量分析，黄娇等（2009）对溶剂法测定木质素含量进行了探索，Derkacheva 和Tsypkin（2018）利用光谱法对纸浆中的木质素含量进行了定量分析；但是这些测定方法的灵敏度及应用范围等均有限，Klason 法更适合硬木木质素等含量高的样品测定（李海涛 等，2011），传统的称重法预处理步骤繁琐、试验过程耗时且误差大，光谱法、色谱法所需设备要求高、成本高（王君 等，2019）。本试验所建立的比色法测定大白菜中的木质素含量线性范围大、精密度高、回收率高、简单快捷，能够满足大白菜中木质素含量的分析要求，适用于大量样品的快速检测，可以更好地为大白菜品质育种提供技术支撑。

在建立比色法测定大白菜木质素含量的试验过程中发现，乙酰溴的沸点为75～77 ℃，试剂盒体系中反应温度为80 ℃，在高温加热时离心管易开盖而影响吸光值，且有迸溅伤人的风险。本试验优化后的比色法，降低反应温度至70 ℃，既能满足试验要求，又提高了准确度及安全系数；采用的试验试剂、设备普通常用；与液相色谱法、核磁共振法、滴定法等相比，操作较为简单，可批量进行测定，效率高，重复性好，精确度高。此外，乙酰溴为挥发性药品，毒性较强，为减少误差及保证安全需要尽可能操作迅速。

正交试验极差分析是数理统计的重要方法，广泛应用于农业领域，可以简单、直观地判断试验各因素的主次和变异大小。本试验通过正交试验极差分析，确定乙酰溴浓度是影响大白菜木质素含量测定的主要因素，其次是反应温度和反应时间，以此顺序进行单因素梯度试验验证与优化，确定在30%的乙酰溴浓度，70 ℃的反应温度，40 min 的反应时间条件下，可以简便、准确地测定大白菜木质素含量。

本试验中，不同类型和表型性状的大白菜材料木质素含量差异较大，其中木质素含量最高的9号材料为玉田包尖类型，植株直立紧凑、叶球高桩直筒形，叶纹适中，商品性好，耐贮藏，丰产抗病；含量最低的7 号材料也是玉田包尖类型，但相对矮小且不包心；4、5、6 号材料亦为玉田包尖类型，叶球直筒拧抱、紧实，顶部稍尖、圆锥状，耐贮藏，不易抽薹，品质优良，木质素含量有一定差异；10、11 号材料为叠抱类型的橘红心大白菜，12、13、14 号材料为叠抱圆球形或圆柱形早熟大白菜品种，木质素含量差异不大且处于参试材料的中等水平；1、2、3 号材料为合抱筒形大白菜，其中1 号材料为中熟品种，株型相对较大，而2、3 号材料为早熟品种，株型相对较小，与之相对应的1 号材料木质素含量明显高于2、3 号材料。由此可见，植株高大、耐贮存、抗病性强的大白菜品种木质素含量相对较高，这也与木质素在植株中所起的支撑、刚性作用相吻合；植株开展度小、早熟、不结球的大白菜品种木质素含量相对较低；品质优良、株型适中、抗逆性好的叠抱类型大白菜品种木质素含量处于两者中间。今后将进一步扩大检测群体，探究大白菜木质素含量与其表型性状之间的相关性，以期为大白菜品质育种提供技术支撑。