基于SLAF-seq技术开发芋肉纤维颜色性状的分子标记

孙亚林 王直新 季 群 刘玉平 黄新芳 朱红莲 柯卫东

（武汉市农业科学院蔬菜研究所，湖北武汉 430207）

芋（Colocasia esculenta）为天南星科芋属多年生单子叶草本植物。园艺学上可分为魁芋、多子芋和多头芋等几种栽培类型。芋主要食用其地下球茎，粮菜兼宜。魁芋中有一类因芋肉（即地下球茎可食用部分）纤维颜色呈现出紫色槟榔花纹而被称作槟榔芋，以品质优良闻名海内外，在我国广西、广东、福建、湖南等地区广泛栽培（丘培姣和钟玉芳，2015；董伟清 等，2019）。

槟榔芋一般栽培条件下很少开花，主要依靠球茎无性繁殖。目前生产上槟榔芋一般采用地方品种，品种结构较为单一。近年来，已陆续开展了芋的赤霉素开花诱导和杂交育种工作（孙亚林 等，2010；刘独臣 等，2017），Quero-García 等（2006a）研究表明有性杂交是选育优质、抗病、高产的芋新品种最有效的方法。目前，SSR、SRAP、SNP 等已广泛应用于蔬菜品质性状的分子标记研究中（饶立兵 等，2015；刘哲 等，2016），但关于芋品质性状的分子标记报道较少。Quero-García 等（2006b）构建了芋的第一张遗传图谱，找到了与芋产量、球茎直径相关的QTL 位点，同时鉴定了控制芋肉黄色性状的基因，认为其受1 对显性基因控制。

芋肉纤维颜色主要有白、黄、棕、紫等（黄新芳和柯卫东，2006），其中芋肉纤维呈紫色被认为与芋球茎的品质紧密相关，因而最受市场欢迎。Lebot 等（2017）研究表明芋肉紫色纤维中含有10种黄酮类物质，具有抗氧化、消炎和保护神经等保健功能。芋肉纤维颜色易识别，且能稳定遗传，在芋遗传育种中可作为理想的形态标记；但芋生长周期长，该性状只有在芋球茎成熟收获后才能进行鉴定，费力耗时，因此开发芋肉纤维颜色性状的分子标记具有重要的育种价值。

SLAF-seq（specific length amplified fragment sequencing）是一种基于限制性内切酶和高通量测序技术的基因分型策略，通过对特定片段进行二代测序获得海量的、多态性标签序列来充分代表目标物种的全基因组信息（Sun et al.，2013）。该技术具有步骤简单、成本低、高通量的优点，已在SNP分子标记开发和遗传图谱构建等领域得到广泛的应 用（Luo et al.，2016；Ye et al.，2016）。目 前，通过SLAF-seq 技术在芋上开发特异分子标记的相关研究尚未见报道。本试验利用SLAF-seq 技术获取了与芋纤维颜色性状紧密关联的多态性SLAF 标签，进而开发出一批特异性强、稳定性好的SNP标记，以期为芋分子标记辅助育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2017年1—8 月在武汉市江夏区国家种质武汉水生蔬菜资源圃露地进行，以国家地理标志产品荔浦芋（芋肉纤维呈紫色）为母本（P1），乐平野芋（芋肉纤维呈黄色）为父本（P2），通过赤霉素诱导开花杂交得到F1，再由F1自花授粉获得包含272 个单株的F2群体。球茎成熟后分别对父母本、F1及每个F2单株的球茎进行纵切，对芋肉纤维颜色进行田间鉴定。

1.2 DNA 提取以及混池构建

选取母本荔浦芋和父本乐平野芋各5 株，并从F2群体中经芋肉纤维颜色鉴定筛选出颜色紫色和黄色植株各40 株。采用CTAB 法提取每个单株幼嫩叶片的DNA。采用1%琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测基因组DNA 的完整性和纯度。然后将父本乐平野芋5 株、母本荔浦芋5 株、F2群体中芋肉纤维紫色和黄色极端表型的40 个单株的DNA 分别等量混合，至终浓度为40ng·μL-1，形成4 个混池，用于SLAF-seq 建库测序。

1.3 酶切建库

利用限制性内切酶对检测合格的4 个混池的基因组DNA 分别进行酶切，对得到的酶切片段（即SLAF 标签）进行3′端加A 处理、连接Dualindex 测序接头（Kozich et al.，2013）、PCR 扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用Illumina HiSeqTM2500 进行上机测序。因芋尚无参考基因组序列信息发布，为评估酶切试验的准确性，选用水稻品种日本晴（Oryza sativaL.japonica.cv.Nipponbare）为对照进行测序（International Rice Genome Sequencing Project，2005）。日本晴基因组大小为374.31 Mb，其序列下载地址为http：//rice.plantbiology.msu.edu。测序由北京百迈克生物科技有限公司完成。

1.4 SLAF 标签和SNP 标记开发

测序产生的reads 来源于同一限制性内切酶对不同样品作用产生的长度相近的酶切片段，根据序列相似度将各样品的reads 进行聚类，聚类到一起的reads 来源于一个SLAF 片段（SLAF 标签）。同一SLAF 标签在不同样品间的序列相似度远高于不同SLAF 标签间的相似度；在不同样品间序列有差异（即有多态性）的SLAF 标签，即可定义为多态性SLAF 标签。

1.5 关联分析

通过混池间的基因型频率差异进行标记关联分析，寻找混池之间基因型频率的显著差异，用Δ（SNP index）统计（Abe et al.，2012）。SNP 与性状的关联度越强，Δ（SNP index）越接近于1。由于芋目前尚无参考基因组序列，以0.999 分位点0.9 作为与性状显著关联的阈值，大于该阈值的标记则为与性状显著关联的标记。

1.6 分子标记的开发及稳定性检测

利用Primer Premier 5.0 软件，针对关联到的SNP 位点设计AS-PCR（allele specific PCR，等位特异性PCR）引物，引物3′端与模板互补或错配，并在3′端的第2 或第3 位人为引入错配碱基，该错配碱基与3′末端的错配碱基共同作用，减少引物与其3′末端不互补的模板之间的错误延伸。根据与芋肉纤维颜色显著关联的SNP 位点共设计42组引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反应体系共25μL，含100ng·μL-1模板DNA1μL、2×Taqmix12.5μL（含Taq酶、dNTP、Mg2+）、10μmol·L-1正向和反向引物各1 μL、ddH2O9.5μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，45～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2 结果与分析

2.1 遗传分离群体的构建

以芋肉纤维紫色的荔浦芋为母本，芋肉纤维黄色的乐平野芋为父本，杂交获得F1，然后自交构建F2分离群体。在F2群体中芋肉紫色纤维密集程度呈现连续变化（图1），表明芋肉纤维颜色为数量性状。为了开发芋肉纤维颜色的分子标记，在F2群体中筛选芋肉纤维紫色和黄色材料各40 份，用于BSA（bulked segregant analysis）分析。

2.2 测序数据统计与评估

用限制性内切酶EcoR Ⅴ和ScaⅠ对芋基因组进行酶切，酶切片段长度在364～464 bp 的序列定义为SLAF 标签。为保证分析质量，采用100 bp 双端测序进行后续的数据评估和分析。通过对水稻日本晴测序数据的评估监控试验过程是否正常，确定酶切方案实施的有效性。

利用Illumina HiSeqTM2500 平台进行测序，共获得37.65 Mb reads 数据，对各样品的测序数据进行评估（表1）。测序后各样品所获的reads 数目在3 909 833～13 575 917 范围内，测序质量值Q30为94.41%～95.21%，均在90%以上，说明测序碱基错误率低，所获数据合格。测序获得GC 含量的范围在39.59%～40.28%。

表1 各样本测序数据统计结果

2.3 SNP 位点开发及关联分析

SLAF 标签亲本平均深度为44.43×，混池平均深度为57.62×。其中父本的测序深度为55.78×，母本的测序深度为33.09×，aa 池的测序深度为54.01×，ab/bb 池的测序深度为61.22×（表2），累计开发了293 363 个SLAF 标签。采用GATK 软件检测SNP 位点，共得到134 372 个SNP，其中芋肉纤维紫色的母本得到107 190 个SNP，芋肉纤维黄色的父本得到124 912 个SNP，芋肉纤维紫色混池得到128 317 个SNP，芋肉纤维黄色混池得到130 247 个SNP。SNP 杂合率为19.31%～70.86%。

表2 SLAF 标签和SNP 位点统计

在SNP-index 关联分析前，需要先对134 372个SNP 进行过滤，过滤掉有多重突变的SNP 位点共358 个，再过滤掉混池中read 支持度小于4 的位点38 642 个，再过滤掉混池中基因型一致的位点共12 239 个，再过滤掉亲本中不存在的SNP 位点共25 423个，最终获得57 710个SNP用于后续分析。

采用SNP-index 方法计算关联值，以0.999 分位点0.9 作为阈值，筛选出与性状关联程度较显著的27 个SNP 位点（表3）。

表3 与芋肉纤维颜色性状连锁的SNP 标记

2.4 芋肉纤维颜色相关连锁分子标记的开发

根据关联分析获得的SNP 标记，共设计42组引物开展筛选。通过对纤维紫色、黄色和双亲的基因组DNA 模板进行AS-PCR 扩增，结果表明，Marker44764（引物序列Marker44764-F：5′-GCTATTCAGTTCTATGTTGATTACC-3′，Marker44764-R：5′-CATCACACCAGGACCTCTA C-3′）能较好地区分芋肉纤维颜色性状，在母本和F2中芋肉纤维紫色的单株中均能扩增出245 bp 的特异条带，父本和F2中18 个芋肉纤维黄色的单株均不能扩增出特异条带，仅有2 个芋肉纤维黄色的F2单株扩增出了条带，该标记在F2分离群体中的检出率达到95%（图2），表明该标记与芋肉纤维颜色性状紧密连锁，可用于芋杂交后代的苗期分子标记辅助选择。

3 讨论

3.1 SLAF-seq 测序技术应用

SLAF-seq 技术是对传统BSA 方法的升级，可在全基因组水平进行SNP 扫描，相比SSR、AFLP、RAPD 等传统分子标记技术，无论从标记数量，还是稳定性等方面，SLAF-seq 技术都具有无可比拟的优势。该技术同时适用于没有参考基因组的作物，能有效克服基因组复杂、序列与标记信息缺乏等问题，可在较短时间内完成较高深度的简化基因组测序和大规模SNP 标记开发。目前，SLAFseq 技术已广泛应用于小麦、大豆、油菜、甜瓜等多种作物（张红 等，2015；Xia et al.，2015；Geng et al.，2016；Yin et al.，2018），并取得了显著的效果。如杜龙岗和王美兴（2018）通过SLAF-seq 技术对玉米果皮纤维素含量进行研究，对亲本和重组自交系群体的极端单株混池进行SLAF 测序，共获得73 786 个SLAF 多态性标签，检测到523 395 个SNP 位点，获得6 个控制玉米果皮纤维素含量的染色体区段，并确定了9 个候选基因。

目前，芋参考基因组序列尚未公布，利用常规方法开发与芋特定性状连锁的分子标记耗时长、难度大。本试验通过SLAF-seq 技术，共获得37.65 Mb 的reads 数据，从293 363 个SLAF 标签上开发获得57 710 个高质量的SNP 位点，从中筛选到27个与芋肉纤维颜色性状紧密关联的差异标记。

3.2 关于芋肉纤维颜色性状的分子标记辅助选择

Ivancic 等（2003）对702 份芋杂交后代各性状进行调查，并进行表型性状关联分析，相关性分析结果表明，芋肉颜色和芋肉纤维颜色可以通过对叶柄基部的颜色和叶柄下部（基部上方2～3 mm）的颜色进行评分来确定，可以在植株生长前期完成，加快循环选择过程。但该方法也存在局限性，如果亲本基因型改变，杂交后代的评分模型可能会发生改变，导致结果出现错误。通过分子标记辅助筛选可以克服这个问题，首先，分子标记不受环境、亲本基因型的影响；其次，选择效率更高，分子标记辅助选择可以在苗期进行，可在早期对目标性状进行筛选，省时省力。分子标记辅助选择可极大提高选择的效率，加速作物的遗传改良（Collard &Mackill，2008）。本试验是国内进行芋品质性状分子标记开发的首次尝试。利用SLAF-seq 技术筛选出与芋肉纤维颜色性状紧密关联的SNP 位点27个，通过AS-PCR 技术进行SNP 位点多态性验证，获得了1 组引物，具有良好基因分型效果。分子标记与之前的形态标记相比，特异性、灵敏度、稳定性均显著提高。通过对40 个单株进行检测验证，结合田间鉴定结果，其准确率达到95%，能极大地提高育种选择效率。

4 结论

通过SLAF-seq 技术测序获得芋37.65 Mb 的数据，基于293 363 个SLAF 标签，开发了57 710个高质量的SNP 位点。筛选到27 个与芋肉纤维颜色性状紧密关联的SNP 位点。通过AS-PCR 技术进行SNP 位点多态性验证，其中Marker44764 操作简单、稳定性好，能有效实现芋肉纤维颜色早期基因分型，可对芋育种材料进行苗期的分子标记辅助选择，提高芋杂交育种的单株选择效率。