青钱柳多酚提取工艺及抗氧化活性

张怡评 ，杨婷 ，洪专 ，卢绍基*，邓明

1.自然资源部第三海洋研究所，海洋生物资源开发利用工程技术创新中心（厦门 361005）；2.厦门塔斯曼生物工程有限公司（厦门 361021）

青钱柳（Cyclocarya paliurus（Batal）Iljinskaja.）又名摇钱树，系胡桃科青钱柳属植物，多分布于热带和亚热带的山区，是中国特有的单种属植物及国家重点保护的濒危植物之一，主产于江西、湖南、贵州、广西、湖北等地[1]。青钱柳的树叶、树皮、树根都可以入药，也可作为普通的食品原料，具有清热解毒、生津止渴、止痛等功能[2]。研究发现，青钱柳叶含有多糖类、黄酮类、三萜及有机酸类化合物及一些无机元素等[3-7]，具有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化及调节机体免疫等多种生物活性[4-5,8-11]。关于青钱柳抗氧化活性研究主要集中在青钱柳多糖及黄酮类化合物上，体外抗氧化活性研究表明，青钱柳多糖及总黄酮能够清除DPPH自由基、ABTS自由基及羟基自由基活性；大鼠体内抗氧化活性研究表明，青钱柳多糖能够使高血脂大鼠肝脏的总超氧化物歧化酶的活性、谷胱甘肽过氧化物酶的活性、过氧化氢酶的活性及总抗氧化（T-AOC）显著提高[12-15]。近年来，青钱柳叶作为食品、保健品的研究开发是其研究的重点，已有青钱柳保健茶等功能性食品上市[16]，然而，尚未见青钱柳多酚的提取及抗氧化活性的研究报道，试验采用乙醇提取法提取青钱柳多酚化合物，对其抗氧化活性进行评价，为青钱柳功能性食品的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

青钱柳（采自贵州省雷山县，样品留存厦门塔斯曼生物工程有限公司）；没食子酸（纯度98%，批号110831-201906，中国食品药品检定研究院）；福林酚试剂、碳酸钠、无水乙醇、邻苯三酚、Tris-HCl试剂、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等（均为分析纯，购自汕头西陇化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

KQ5200E超生波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；UH5300紫外可见分光光度计（日立株式会社制作所）；DFT-200A万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；HH-ZK2水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；NT-901涡旋振荡器（海门市其林贝仪器制造有限公司）；H1650-W离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 青钱柳多酚提取单因素试验

取青钱柳叶，粉碎，过0.180 mm粒径筛，以乙醇体积分数（40%，50%，60%，70%和80%）、超声提取时间（10，20，30，40，50和60 min）、超声提取温度（30，40，50，60和70 ℃）、料液比（1∶5，1∶15，1∶25，1∶35，1∶45和1∶55 g/mL）为单因素进行考察，筛选正交试验因素及水平。

1.3.2 青钱柳多酚提取工艺优化

在单因素基础上采用四因素三水平正交试验设计进行优化。采用乙醇体积分数（60%，70%和80%）、超声提取时间（10，20和30 min）、超声提取温度（40，50和60 ℃）、料液比（1∶25，1∶35和1∶45 g/mL）为单因素，正交试验设计因素水平表见表1。

表1 正交试验设计因素水平表

1.3.3 青钱柳多酚含量的测定

参照国标方法，采用福林酚测定法进行测定[17]。即以没食子酸为标准品，配制成20 μg/mL标准没食子酸溶液。分别吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL的没食子酸标准溶液（20 μg/mL）置于10 mL离心管中，向试液中依次加入1.5 mL福林酚试剂和4 mL 8%碳酸钠溶液，最后加水补齐到10 mL，涡旋混合后将离心管放置于30 ℃水浴中反应20 min，分别测定765 nm处溶液的吸光度。以没食子酸浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标绘制标准曲线。没食子酸标准曲线见图1，回归方程为y=0.031x+0.043 3，R2=0.999，在4～20 μg/mL质量浓度范围有良好的线性关系。吸取1 mL样品液自加入福林酚试剂起按照步骤进行测定吸光度，用标准曲线计算多酚含量。

图1 没食子酸标准曲线

1.3.4 青钱柳多酚体外抗氧化活性研究

试验参考文献[18]方法，对青钱柳多酚的体外抗氧化活性进行评价，主要包括超氧阴离子自由基清除率测定、铁离子还原力测定和DPPH自由基清除率测定。

1.3.4.1 超氧阴离子自由基清除率测定

邻苯三酚的自氧化反应：取2 950 μL pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl于石英比色皿中，加入50 μL 30 mmol/L的邻苯三酚溶液，迅速混合，测定在波长325 nm的吸光度，每隔30 s测1次，300 s后停止，吸光度随时间的变化即斜率为ΔA0。样品溶液：取适量浓度的样品XμL于石英比色皿中加入（2 950-X）μL pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl，加入50 μL 30 mmol/L的邻苯三酚溶液，迅速混合，测定在波长325 nm的吸光度，每隔30 s测1次，300 s后停止，吸光度随时间的变化即斜率为ΔA样，计算对超氧阴离子自由基清除率的影响。

1.3.4.2 铁离子还原力测定

吸取1 mL一定浓度的多酚提取液于具塞试管中，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸缓冲盐和1 mL 1%的铁氰化钾，混匀，50 ℃恒温水浴20 min后，取出急速冷却（冰欲），加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混合后以3 000 r/min离心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL双蒸水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀静置10 min，在700 nm波长下测定吸光度。

1.3.4.3 DPPH自由基清除率测定

取适量DPPH，用乙醇配制成质量浓度为0.04 mg/mL的溶液，避光储存备用。取1.5 mL DPPH溶液，加适量提取液用乙醇补足到3 mL，静置30 min，在517 nm波长下测定吸光度。将样品配制成一定的浓度按照上述反应后测定，计算出对DPPH自由基清除率的影响。

式中：A0为未加提取液时DPPH溶液的吸光度；A1为加提取液时DPPH溶液的吸光度；A2为提取液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对青钱柳多酚提取率的影响

分别精密称取5份青钱柳粉，各2.0 g，固定料液比1∶25（g/mL）、提取时间25 min，分别加入40%，50%，60%，70%和80%乙醇水溶液超声提取，离心，上清液稀释20倍后，按照1.3.3的方法进行测定并计算多酚提取率。

由图2可见，随着乙醇体积分数增加，青钱柳多酚的提取率先增加后下降，乙醇体积分数70%时，多酚的提取率最高，达到1.76%，采用80%乙醇提取，多酚提取率下降明显。因此，乙醇体积分数选择60%，70%和80%这3个水平进行正交试验。

图2 乙醇体积分数对青钱柳多酚提取率的影响

2.1.2 超声提取时间对青钱柳多酚提取率的影响

分别精密称取6份青钱柳粉，各2.0 g，固定料液比1∶25（g/mL），分别加入70%乙醇超声，提取10，20，30，40，50和60 min，离心，上清液稀释20倍后，按照1.3.3的方法进行测定。

由图3可见，随着超声提取时间增加，多酚提取率逐渐升高，超声提取时间从10 min到20 min提取率升高迅速，超声提取20 min时的提取率为1.78%；超声提取时间从20 min到50 min提取率升高趋势趋于平缓，超声提取时间50 min时，提取率为1.90%，延长30 min，提取率仅提高0.12%。因此超声提取时间选择10，20和20 min这3个水平进行正交试验。

图3 超声提取时间对青钱柳多酚提取率的影响

2.1.3 超声提取温度对青钱柳多酚提取率的影响

分别精密称取5份青钱柳粉，各2.0 g，固定料液比1∶25（g/mL），分别加入70%乙醇，于30，40，50，60和70 ℃超声提取20 min，离心，上清液稀释20倍后，按照1.3.3的方法进行测定。

由图4可见，随着提取温度增加，青钱柳多酚的提取率先增加后下降，提取温度达到50 ℃时，青钱柳多酚的提取率达到最高，为1.83%；提取温度高于50℃时，多酚的提取率反而下降，可能是由于温度过高导致多酚被破坏。因此，超声提取温度选择40，50和60 ℃这3个水平进行正交试验。

图4 超声提取温度对青钱柳多酚提取率的影响

2.1.4 料液比对青钱柳多酚提取率的影响

分别精密称取6份青钱柳粉，各2.0 g，采用不同料液比（1∶5，1∶15，1∶25，1∶35，1∶45和1∶55 g/mL），分别加入70%乙醇，于50 ℃超声提取20 min，离心，上清液稀释20倍后，按照1.3.3的方法进行测定。

由图5可见，多酚提取率随着料液比增加而升高，料液比增加到1∶35（g/mL）后，多酚的提取率增加趋于缓慢，因此料液比选择1∶25，1∶35和1∶45（g/mL）这3个水平进行正交试验。

图5 料液比对青钱柳多酚提取率的影响

2.2 正交试验结果

在青钱柳多酚提取单因素试验结果基础上，以青钱柳多酚提取率为评价指标，以乙醇体积分数（A）、超声提取时间（B）、超声提取温度（C）和料液比（D）为4个提取因素，每个因素设定3个水平，采用四因素三水平正交试验法进行提取工艺优化，按照1.3.3的方法进行测定，试验结果见表2。

表2 正交试验结果

由表2青钱柳多酚提取正交试验直观分析结果可得，超声提取时间对多酚提取率影响最显著，料液比次之，乙醇体积分数对青钱柳多酚的提取率的影响最小。由表3方差分析结果可得提取时间对多酚提取率具有显著性影响，试验结果可得最佳提取工艺为A1B3C2D3，即以60%乙醇、料液比1∶45（g/mL），在50 ℃下超声提取30 min为最佳提取工艺。

表3 正交试验方差分析结果

2.3 工艺验证试验结果

精密称取3份青钱柳粉，各2 g，按照确定的最佳提取工艺进行提取并测定，结果见表4。

表4 验证试验结果 单位：%

在选取的最佳提取工艺条件下，青钱柳多酚的平均提取率为1.87%，相对标准偏差为2.12%，所建立的最佳提取工艺稳定可行。

2.4 青钱柳多酚体外抗氧化活性试验

2.4.1 青钱柳多酚的提取

取100 g青钱柳，根据正交试验优化的最佳提取工艺进行提取多酚，过滤，滤液浓缩后冷冻干燥，开展体外抗氧化试验研究。

2.4.2 超氧阴离子清除率测定结果

人体内存在一定数量的超氧阴离子，不发生化学变化对人体无害，但与羟基（OH-）结合后的产物会导致细胞DNA损坏，破坏人类机体功能，因此，适当摄入具有清除自由基活性的食物，对于保护人体机体功能具有重要意义[3,9]。由图6可知，青钱柳多酚提取物对超氧阴离子的清除率呈剂量依赖性关系，相关系数为0.976，青钱柳多酚对超氧阴离子的IC50值为120.96 μg/mL。

图6 青钱柳多酚对超氧阴离子的清除效果

2.4.3 铁离子还原力测定结果

样品的还原力与其抗氧化性具有明显相关性，一般样品的吸光度越大，样品的还原力越强，其抗氧化活性越强[18]。测定青钱柳多酚对铁离子还原力，试验发现青钱柳多酚对铁离子还原力随着浓度增加而增强，青钱柳多酚对铁离子还原力的IC50值为9.84 μg/mL，见图7。

图7 青钱柳多酚对铁离子的还原力

2.4.4 DPPH自由基清除率测定结果

DPPH是一种有机自由基，被广泛应用于定量检测食品的抗氧化能力[18]。试验考察青钱柳多酚对DPPH自由基的清除能力。结果发现，随着青钱柳多酚质量浓度增加，其DPPH自由基清除能力增强，其质量浓度与清除率相关性为0.995，青钱柳多酚对DPPH自由基清除率的IC50为5.81 μg/mL，见图8。

图8 青钱柳多酚对DPPH自由基清除效果

3 结论

人体内正常的生理代谢过程也会产生含氧自由基，很多疾病和组织损坏都和体内的氧化应激反应有联系，如果自由基过量就会加快细胞衰老，引起疾病[9]。前期有药理研究发现青钱柳提取物（多糖或黄酮类物质）有清除自由基等抗氧化活性[9,13]，但尚未见青钱柳多酚提取的研究报道。采用单因素试验结合正交试验，建立青钱柳多酚的最佳提取工艺：以60%乙醇、料液比1∶45（g/mL），在50 ℃下超声提取30 min，在此工艺下，青钱柳多酚的提取率可达1.96%。同时，对青钱柳多酚的体外抗氧化活性进行评价，结果表明，青钱柳多酚对DPPH自由基的清除率及铁离子还原力较强，而对超氧阴离子自由基的清除率较弱，试验结果可为青钱柳多酚在功能性食品等开发应用上提供参考。