闪式提取法制备大叶千斤拔醇提物及其抑菌活性

熊建文，卢凯玲，陈正培，谢琳，韦鑫梦

柳州工学院（柳州 545616）

大叶千斤拔（Flemingia macrophylla），又名大猪尾、千斤力、千金红、红药头和白马屎等，是豆科千斤拔属植物，为药食同源植物，主要分布在我国广西、广东、海南、云南等地[1]。大叶千斤拔中含有多种结构的化合物[2-4]，木质部中含有5、7、2′、4′-四羟基异黄酮；树皮中含有羽扇豆醇、α-香树脂醇、谷甾醇、原矢车菊素、香豆素与谷甾醇葡萄糖苷；叶片及花萼中含有千斤拔色烯查耳酮C、D、E、F；根茎含有酰胺类、蒽醌类、挥发油类、黄烷酮类化合物[5-6]。其中，黄酮类物质含量最高的化合物为染料木素和染料木苷。在生物活性方面的研究初步表明大叶千斤拔提取物具有消炎、镇痛，免疫增强，促进周围神经，感觉神经损伤修复，类神经营养因子，对脑组织和血脑屏障有保护等作用[7]，分离得到的黄酮类化合物具有抗炎症[8-9]，抗氧化[10-11]，抗肿瘤[12-13]，抗微生物和类荷尔蒙活性等作用[14-15]。目前对大叶千斤拔醇提物的抑菌活性的研究很少，并且对不同方法制备的醇提物进行生物活性的研究尚未见报道。此次试验以大叶千斤拔染料木素的得率为指标，对大叶千斤拔的醇提工艺进行研究和优化，并对不同方法制备的大叶千斤拔醇提物抑菌活性进行研究，将为大叶千斤拔醇提物的下一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大叶千斤拔药材（广西药用植物园提供）；超纯水（净水器净化而成）；染料木素标准品（中国生物药品制品检定所，批号：13080816）；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、真菌有啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）、黑曲霉（Aspergillus niger）菌种，柳州工学院微生物实验室；牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，YPD培养基；甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸、无水乙醇等国产分析纯；营养琼脂、牛肉膏、蛋白胨等生物试剂。

1.2 仪器与设备

岛津LC-20A高效液相色谱仪（岛津企业管理（中国）有限公司）；ME104型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器）；旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（河南省予华仪器有限公司）；闪式提取仪（上海元析仪器有限公司）；UV-2600紫外分光光度计（岛津企业管理（中国）有限公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ZXRD-7080全自动新型鼓风干燥烘箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；ZHJH-1112C垂直流超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 大叶千斤拔药材的预处理

大叶千斤拔（包含茎、叶）晒干后用剪刀剪成小段，放进搅拌器里进行粉碎，过0.250 mm粒径筛待用。将粉碎完的药材粉末用密封袋干燥保存待用。

1.3.2 醇提取物中染料木素的含量测定

1.3.2.1 染料木素标准品溶液制备

精密称取0.008 0 g染料木素标准品，用色谱甲醇溶解，定容于10 mL棕色容量瓶中，充分摇匀，即得质量浓度为0.8 mg/mL的染料木素标准品溶液。

1.3.2.2 色谱条件选择

按照蔡锦源等[16]的测定方法，设置色谱条件，采用自动进样器。精密吸取1 μL染料木苷标准品溶液，5 μL大叶千斤拔样品溶液。染料木素的理论塔板数＞5 000，与相邻的色谱峰分离度＞1.5，样品中染料木素色谱峰能与其他色谱峰达到基线分离。

1.3.2.3 染料木素标准曲线制作

精密吸取1 mL 1.3.2.1小节配制好的染料木素标准品溶液，用色谱纯甲醇稀释，定容于10 mL棕色容量瓶中，即可得到稀释的待测染料木素标准品溶液，溶液浓度为每毫升中含有0.08 mg染料木素。用0.45 μm微孔滤膜过滤，待用。设置高效液相色谱自动进样器，每次分别进样1，3，5，7，9和11 μL，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，即得到线性回归标准曲线方程y=40 915.06x+295.21，R2=0.999 8，表明染料木素标准品溶液在0.08～0.88 μg内线性关系良好。

1.3.2.4 染料木素含量的测定

将不同提取方法得到的提取液用上所述HPLC法进行检测，染料木素得率按式（1）进行计算。

1.3.3 闪式提取法的优化

1.3.3.1 单因素试验

采用闪式提取器，精准称取1 g大叶千斤拔样品粉末，置于提取罐中，分别选取提取时间（1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 min）、液料比（10∶1，20∶1，30∶1，40∶1和50∶1 mL/g）、乙醇体积分数（30%，40%，50%，60%和70%）3个因素进行单因素试验，考察这3个因素对大叶千斤拔染料木素得率的影响。

1.3.3.2 正交试验设计

在单因素试验的基础上，采用正交设计表L9(34)，对大叶千斤拔染料木素闪式提取工艺的主要影响因素进行正交因素与水平试验设计，试验因素与水平表见表1。

表1 正交设计试验因素与水平表

1.3.4 提取方法

1.3.4.1 加热回流法

按照牛迎凤等[17]的加热回流法最优提取工艺，取大叶千斤拔样品粉末，精准称取3份，每份1 g置于25 mL圆底烧瓶中，加入20 mL、80%乙醇，称定并记录质量，在80 ℃的温度下，水浴回流提取3.5 h，静置至室温，补足挥发的乙醇，摇匀后用普通定性滤纸过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤，在避光处保存待用。

1.3.4.2 渗漉提取法

参照海莉等[18]的渗漉提取法，在渗漉筒底部放一层棉花，然后再覆盖一张滤纸，精准称取3份大叶千斤样品粉末，每份3 g置于渗漉瓶中，加入100 mL、80%乙醇溶液置于筒内，慢慢让其渗透浸湿，静置72 h后，打开上下溶剂阀门开始渗漉，控制渗漉液流速在每分钟流出20滴左右，收集滤液，滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤，在避光处保存待用。

1.3.4.3 超声波提取法

按照莫晓宁等[19]的超声波提取的最优工艺，取大叶千斤样品粉末，精准称取3份，每份1 g，置于锥形瓶中，加入35 mL的90%乙醇溶液，超声频率200 W，提取时间15 min，收集滤液，滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤，在避光处保存待用。

1.3.4.4 闪式提取法

按照1.3.3闪式提取法优化后的最优工艺，取大叶千斤拔样品粉末，精准称取3份，每份1 g，置于提取罐中，加入30 mL的50%乙醇溶液，提取时间2.5 min，收集滤液，滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤，在避光处保存待用。

1.3.5 抑菌试验

根据熊建文等[20]的滤纸片琼脂扩散法稍作修改后做抑菌试验。向灭菌好的培养皿中倒入一定量的琼脂培养基，待其凝固后，加入100 μL菌液，均匀涂布后，于37 ℃细菌培养箱（30 ℃霉菌培养箱）中静置30 min。将滤纸片（ø=6 mm）进行灭菌，在滤纸片上加入10 μL大叶千斤拔提取物，以10 μL对应质量分数的乙醇溶液作为阴性对照，用10 μL 3 mg/mL苯甲酸钠作为阳性对照。然后置恒温培养箱中培养（细菌36～37 ℃，18～24 h；真菌28～30 ℃，48～72 h），观察并通过十字交叉法记录抑菌圈大小。以上步骤均按无菌条件操作，每样品设3个平行样，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对染料木素得率的影响

由图1可知，液料比不断增大时，染料木素得率也增大，在液料比为30∶1（mL/g）时染料木素得率最高，继续增大，染料木素得率反而开始下降。原因可能是适当增大液料比有利于提高染料木素得率，但是继续加大液料比，闪式提取器对植物细胞的剪切和破坏效果减弱，导致染料木素溶出较少，使得染料木素得率降低，故液料比以30∶1（mL/g）为佳。

图1 液料比对染料木素得率的影响

2.1.2 乙醇体积分数对染料木素得率的影响

由图2可知，乙醇体积分数不断增加时，染料木素得率随乙醇体积分数的增大先增大后减小，并在50%时达到最大值。原因是可能随着乙醇体积分数的增加，细胞的溶涨增大，乙醇溶液向细胞内部渗透增大，有效提高了得率，乙醇的体积分数继续增大，溶剂极性越来越低，除染料木素外的其他物质提取率增大，反而影响染料木素的提取，故乙醇体积分数在50%为佳。

图2 乙醇体积分数对染料木素得率的影响

2.1.3 不同提取时间对染料木素得率的影响

从图3不同提取时间对染料木素的影响中可以看到，随着提取时间的增加，染料木素得率先升高再降低，在2.5 min时染料木素得率最高。原因可能是随着提取时间的延长，闪式提取器对植物细胞的剪切和破坏效果增大，使得染料木素的得率增加。但是时间过长，可能会导致化合物结构被破坏，从而使得染料木素得率降低，故提取时间以2.5 min为宜。

图3 不同提取时间对染料木素得率的影响

2.2 正交试验结果

按表1的因素和水平进行正交试验设计，结果如表2正交试验结果所示。由表2可看出，不同因素对闪式提取工艺的影响顺序为A＞B＞C，最优工艺组合为A2B2C2，即液料比30∶1（mL/g）、乙醇体积分数50%、提取时间2.5 min。由表3正交试验结果和方差分析可知，A和B对结果有显著影响，而C对结果无显著影响。按最优工艺条件分别进行3次提取试验，染料木素的平均得率为0.51 mg/g，表明试验方案设计稳定、可行。

表2 正交试验结果

表3 正交试验结果和方差分析

2.3 不同方法制备大叶千斤拔醇提物的比较

对采用不同方法制备的大叶千斤拔醇提物进行染料木素得率的测定，结果如图4所示。可以看出，热回流法的得率为0.38 mg/g，渗漉提取法的得率为0.21 mg/g，超声波提取法的得率为0.42 mg/g，闪式提取法的得率为0.51 mg/g。比较4种方式，闪式提取法的得率最高，闪式提取法具有独特的物理特性，能促使植物组织快速破碎或变形，便于有效成分提取分离。

图4 提取方法对大叶千斤拔醇提物的影响

2.4 大叶千斤拔醇提物的抑菌作用

从表4中可以看出，大叶千斤拔醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母有一定的抑菌效果，对黑曲霉基本没有抑制效果。从制备方法上分析，闪式法制备的醇提物抑菌效果：金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠肝菌＞酿酒酵母；超声波制备的醇提物抑菌效果：大肠肝菌＞金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞酿酒酵母；热回流制备的醇提物抑菌效果：金黄色葡萄球菌＞大肠肝菌＞枯草芽孢杆菌＞酿酒酵母；渗漉制备的醇提物抑菌效果大小排序与超声波相同，但整体效果较差，对酿酒酵母和黑曲霉基本没有抑制作用。

表4 不同方法制备的大叶千斤拔醇提取的抑菌效果

3 结论

试验采用闪式提取法制备大叶千斤拔醇提物，通过单因素试验法和正交试验法系统研究乙醇体积分数、提取时间、液料比3个因素对大叶千斤拔染料木素的得率的影响，得出闪式提取法最佳提取工艺条件：乙醇体积分数50%、提取时间2.5 min、液料比30∶1（mL/g），在此条件下染料木素得率为0.51 mg/g。对提取因素的试验数据分析表明，乙醇体积分数和液料比是提取试验的显著因素，提取时间对提取试验的影响相对最小。

对超声波、热回流、渗漉和闪式4种提取方法的最优工艺进行考察和比较，热回流法的得率为0.38 mg/g，渗漉提取法的得率为0.21 mg/g，超声波提取法的得率为0.42 mg/g，闪式提取法得率最高，为0.51 mg/g。闪式提取法提取时间短，不需要加热，节约能源，有效物提取率高，是一种高效快速的提取方法，近年来在天然产物的提取工艺中应用越来越广泛。

大叶千斤拔的醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母有一定的抑菌效果，但对黑曲霉基本没有抑制效果。可能是醇提物中存在一些黄酮类物质，它们通过抑制拓扑异构酶的活性，影响细菌和真菌DNA的复制与合成、蛋白质的合成等，也可以通过破坏菌体的细胞壁和细胞膜的结构来抑制菌体呼吸进而达到抑菌效果。不同方法制备的大叶千斤拔醇提物对几种微生物的抑制作用不同，可能是由于不同的提取方式对活性成分的析出有偏好，导致醇提物中的活性成分存在一定的差异，需要进一步设计试验来研究。