Ghrelin对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞线粒体损伤和细胞凋亡的影响*

高文明 李嘉铮 王慧青 董 康 孟 尧 程葆华△

(1济宁医学院基础医学院；2济宁医学院临床医学院，济宁 272000；3山东大学齐鲁医学院，济南，250014)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常见的神经退行性运动障碍性疾病，以运动和非运动症状为主要临床表现[1]。以中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺能神经元进行性丢失，残存的多巴胺神经元内出现路易小体为主要病理学特征[2]。PD发病的确切机制尚不十分清楚，现有的证据表明线粒体功能损伤与PD 的病理生理学有关[3]。凋亡是最常见的程序性细胞死亡形式，与线粒体功能密切相关，原因是内在的凋亡途径与线粒体去极化有关[4]。6-OHDA是儿茶酚胺的羟基化衍生物，其结构与儿茶酚胺类似，是一种有效导致多巴胺神经元变性的神经毒剂，广泛用于选择性儿茶酚胺能神经毒剂作用的细胞或者动物PD模型[5]。

Ghrelin又名胃饥饿素，是生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的唯一内源性配体[6]。Ghrelin可促进生长激素释放，参与多种内分泌调节过程，具有抗凋亡、抗氧化作用，可以拮抗1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡喃(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyran，MPTP)所致的神经毒性，发挥神经保护作用[7-9]。Ghrelin对于6-OHDA所致的线粒体损伤和细胞凋亡的作用还有待研究。本实验通过6-OHDA处理人神经母细胞癌细胞(SH-SY5Y细胞)，构建PD体外模型，观察Ghrelin对线粒体功能和细胞凋亡的影响，探究其神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂 Ghrelin(美国Phoenix Pharmaceuticals公司)；SH-SY5Y细胞(美国菌种保藏中心)；6-OHDA(美国Sigma公司)；DMEM培养液(美国Hyclone公司)；CCK-8(日本Dojindo公司)；LDH(中国南京建成生物有限公司)；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(中国江苏凯基有限公司)；RIPA裂解液(中国碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国天根生物有限公司)；超敏ECL化学发光试剂盒、Bcl-2抗体(中国万类生物科技有限公司)；Bax抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗体(北京中山金桥有限公司)。

1.1.2仪器 CO2培养箱(美国Thermo公司)；超声波细胞粉碎仪(江苏波场智能科技股份有限公司)；微量移液器(德国 Eppendorf公司)；台式低温高速离心机(美国Beckman公司)；酶标仪、电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；普通光学显微镜、倒置生物显微镜(日本Olympus公司)；激光共聚焦扫描显微镜(SP8)(德国 Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 SH-SY5Y细胞培养在含有10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养基中，放置于37℃含有5% CO2的细胞培养箱中培养，待生长到约90%时进行相应传代或接种到96、6孔板中，行后续药物处理。

1.2.2药物处理及分组 取对数生长期SH-SY5Y细胞，接种于96或6孔板中，随机分成4组：对照组、Ghrelin组、6-OHDA组、6-OHDA+Ghrelin组，置于37℃含有5% CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长到合适密度，Ghrelin组、6-OHDA+Ghrelin组先给予Ghrelin(1μM)预处理，其他两组给予相同剂量的磷酸盐缓冲液(PBS)，6-OHDA组、6-OHDA+Ghrelin组2h后给予6-OHDA(400μM)处理，其他两组给予相同剂量的磷酸盐缓冲液(PBS)，放入培养箱培养24h，后行后续实验操作。

1.2.3细胞活力测定 将对数生长期细胞接种于96孔板内，置于细胞培养箱中，待细胞生长到合适密度，按上述方法进行药物处理。在细胞培养箱继续培养22h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，用锡箔纸包好避光条件下，细胞培养箱孵育2h，孵育结束后用酶标仪450nm处测定吸光度(A)。每组设6个复孔，实验平行重复3次，计算细胞活力。

1.2.4LDH释放量检测[10]取对数生长期细胞接种于96孔板内，置于细胞培养箱中，待细胞生长到合适密度，按上述方法进行药物处理。培养24h后，收集上清液并转移到新的96孔板中，按照LDH检测试剂盒步骤进行操作，反应结束后用酶标仪450nm处测定吸光度(A)。每组设6个复孔，并且设置只加入培养基的空白孔作为空白对照，实验平行重复3次，LDH释放率=给药组LDH活力/空白组LDH活力。

1.2.5线粒体膜电位(ΔΨm)检测[11]JC-1染色法来检测ΔΨm在各处理组中的变化。取对数生长期细胞接种于含有黏附载玻片的12孔板中，待细胞生长到合适密度后进行相应药物处理。24h后，吸去培养基，用PBS洗1次，然后加入JC-1(1x)染色液，避光条件下孵育20min，孵育完成后吸去染色液，用洗涤液洗涤2次，最后放在SP8荧光显微镜下观察拍照，实验平行重复3次，用Image J分析荧光强度。

1.2.6Bcl-2、Bax蛋白表达检测[12]取对数生长期细胞接种于6孔板内，置于细胞培养箱中，待细胞生长到合适密度，按上述方法进行药物处理。培养24h后收集细胞，加入强裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解30min，在12000rpm的4℃离心机离心30min，收集上清即为细胞总蛋白。取10μl用BCA法测定蛋白浓度，剩余蛋白按照3∶1加入相应的4×SDS后，在金属水浴锅煮蛋白10min，室温冷却。随后进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后转移到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭，孵育一抗稀释液，4℃过夜。次日TBST溶液洗膜，二抗稀释液室温孵育1h。再次洗膜3次，加入ECL溶液，暗室内曝光显影。实验平行重复3次，用Image J分析条带灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Ghrelin对6-OHDA处理的SH-SY5Y细胞活力的影响

为了初步探究Ghrelin对6-OHDA诱导PD体外模型的作用，运用CCK-8检测各组细胞经处理后的细胞活力变化。首先，为了验证单独给予Ghrelin是否会对细胞活力产生影响，分别给予0.01、0.1、1、10μM Ghrelin处理细胞，结果显示，不同浓度的Ghrelin对细胞活力没有影响，无毒副作用(图1A)。随后我们研究6-OHDA单独对细胞的毒性作用，结果显示，6-OHDA以剂量依赖性的方式降低了细胞活力(图1B)，我们采用400μM的6-OHDA用于后续实验。最后我们检测Ghrelin预处理对6-OHDA处理的细胞的影响，如图1C显示，0.1、1、10μM Ghrelin改善了6-OHDA介导的细胞活力的下降，我们选择1μM Ghrelin用于后续实验。以上结果表明，Ghrelin对6-OHDA诱导损伤的SH-SY5Y细胞存活存在一定的保护作用。

注：Ghrelin或等剂量PBS提前2h处理细胞，在有或没有6-OHDA的情况下培养24h，CCK-8实验检测细胞活力。(A)单独给予Ghrelin对细胞活力的影响；(B)单独给予6-OHDA对细胞活力的影响；(C)Ghrelin对6-OHDA刺激的细胞活力的影响。**P<0.01，***P<0.001 vs 对照组；##P<0.01,###P<0.001 vs 6-OHDA 组

2.2 Ghrelin对6-OHDA诱导损伤的SH-SY5Y细胞LDH释放率的影响

与对照组相比，6-OHDA导致LDH的大量释放，表明发生细胞死亡；而给予Ghrelin预处理后，与6-OHDA组相比，6-OHDA+Ghrelin组LDH的释放率明显降低，说明Ghrelin降低了6-OHDA所致的细胞毒性作用。见图2。

注：(A)按照上述方法处理细胞，LDH试剂盒检测各组LDH释放量的变化，进一步反映细胞毒性作用。***P<0.001 vs对照组；##P<0.01,###P<0.001 vs 6-OHDA 组

2.3 Ghrelin对6-OHDA处理的SH-SY5Y细胞ΔΨm的影响

与对照组相比，给与6-OHDA处理后，细胞红色荧光强度显著下降，表明ΔΨm下降；而给予Ghrelin预处理后，6-OHDA+Ghrelin组细胞红色荧光强度明显增加，ΔΨm显著上升。表明Ghrelin预处理能部分恢复6-OHDA所致的ΔΨm的下降，具有线粒体保护功能。见图3。

注：(A-B)按照上述方法处理细胞，JC-1实验红、绿荧光强度比值反映ΔΨm的变化。Scale bar = 50 μm。***P<0.001 vs 对照组；###P<0.001 vs 6-OHDA 组

2.4 Ghrelin对6-OHDA诱导损伤的SH-SY5Y细胞Bcl-2和Bax表达的影响

与对照组相比，6-OHDA组Bcl-2/Bax比值降低；而给与Ghrelin预处理后，与模型组相比，6-OHDA+Ghrelin组Bcl-2/Bax的比值明显升高，表明Ghrelin降低了6-OHDA所致的细胞凋亡反应。见图4。

注：(A-B)按照上述实验方法处理细胞，提取细胞总蛋白，运用Western blotting方法检测Bcl-2和Bax的表达，Bcl-2/Bax的比值反映细胞内凋亡水平。***P<0.001 vs 对照组；##P<0.01 vs 6-OHDA 组

3 讨论

PD是一种与年龄有关的中枢神经退行性疾病，威胁人类健康，据统计我国PD患者接近300万，预计2030年全世界将有900万PD患者[13]。PD神经元变性的确切机制尚不十分明确，目前PD 的治疗主要以左旋多巴替代疗法为主，其可以缓解症状，但存在一定的不良反应，且无法阻止疾病的发展，而诸如干细胞治疗，神经核毁损术和脑深部电刺激术等替代策略均有严格的适应证[14]，药物治疗仍然是治疗PD的基石,因此开发一种能快速通过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的靶向药物对于PD的治疗是十分有益的。

Ghrelin作为一个含28个氨基酸的脑肠肽，可以通过BBB在神经系统疾病发挥保护作用。以往有研究报道，Ghrelin通过与受体结合，发挥抗凋亡、抑制胶质细胞激活，在神经退行性疾病的体内外模型中发挥神经保护作用[8,15-16]。本课题组前期研究结果已经证明Ghrelin可以通过促进自噬、抑制内质网应激、激活ERK1/2等信号转导途径对PD的体内外模型发挥神经保护作用[9,17-18]。然而，Ghrelin对6-OHDA诱导的细胞毒性作用及机制仍需要进一步研究。

PD发病机制复杂，既往研究表明，线粒体功能障碍会加重神经元的退变[3]。本文结果显示，Ghrelin预处理增加了细胞活力，降低了细胞毒性作用。6-OHDA可以抑制线粒体复合体Ⅰ，抑制ATP产生，阻断细胞内ATP参与的过程，产生大量自由基，从而导致线粒体功能异常，进一步引起细胞死亡[19]。Ghrelin 显著提高了ΔΨm水平，增加了Bcl-2/Bax的比值，表明Ghrelin降低了6-OHDA所致的线粒体功能损伤和细胞凋亡，有利于线粒体稳态的维持。综上所述，Ghrelin减轻了6-OHDA所致的SH-SY5Y细胞损伤。我们所有的工作旨在进一步探索Ghrelin的潜在分子机制，同时为Ghrelin成为治疗PD的临床药物提供了新的证据。

利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。