急性缺血性脑卒中患者血浆miR let-7b-3p水平及意义

张彩玲

(平顶山市第二人民医院急诊科，河南 平顶山 467000)

脑卒中因其高发病率、高致死率及高致残率而受到国内外临床研究人员的关注[1]。急性缺血性脑卒中约占所有脑卒中患者的80%，最新研究显示，我国急性缺血性脑卒中发病率约为1.5%，每年新增卒中患者1643/10万人[2]。急性缺血性脑卒中发病迅速，易造成患者神经功能损伤及脑组织死亡。因此，急性缺血性脑卒中的防治工作备受临床医师的关注。急性缺血性脑卒中的病情发展是由脂质代谢、糖代谢紊乱等多种因素共同作用的结果[3]。此前有研究应用超敏C反应蛋白、白介素-6及红细胞分布宽度等预测急性缺血性脑卒中患者预后[4-5]，但上述指标易受外界因素的影响，如炎症、贫血等因素，因此特异性均较低，预测价值十分有限。动物试验表明，miR let-7b-3p在颈总动脉闭塞引起的急性缺血性脑卒中大鼠中表达升高，并可通过调节热休克蛋白70的表达参与大鼠急性缺血性脑卒中过程[6]，然而关于miR let-7b-3p与急性缺血性脑卒中患者预后的关系未见报道。因此笔者开展本研究，以期为临床评估急性缺血性脑卒中患者预后提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2016年5月至2019年5月平顶山市第二人民医院收治的355例急性缺血性脑卒中患者作为研究对象。参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[7]对急性缺血性脑卒中进行诊断。纳入标准：(1)符合急性缺血性脑卒中诊断标准；(2)接受早期溶栓治疗；(3)无阿司匹林或氯匹格雷禁忌症；(4)接受随访；(5)首先确诊为该病且入组前未接受相关治疗；(6)签署知情同意书。排除标准：(1)伴有恶性肿瘤；(2)伴有严重主要脏器功能不全者；(3)既往接受颅脑手术史；(4)凝血功能障碍者；(5)脑出血者；(6)短暂性脑缺血发作者；(7)合并造血系统疾病或存在出血倾向者。355例急性缺血性脑卒中患者男性209例，女性146例，年龄42～75岁，平均年龄(56.62±7.20)岁，TOAST病因学分型大动脉粥样硬化性152例、小动脉闭塞性75例、心源性栓塞70例、病因未明确58例。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集入选病例的性别、年龄、吸烟、体质量指数(body mass index,BMI)、高血压、糖尿病、高脂血症、冠心病、病灶数目、急性卒中Or910172治疗试验(TOAST)病因学分型、发病-治疗时间(onset-to-treatment time,ONT)、出血转化等。采用酶联免疫法检测白介素-10、同型半胱氨酸、D-二聚体水平；利用全自动生化分析仪检测糖化红蛋白水平。

1.2.2 血清学指标 抽取入组患者空腹外周静脉血10 mL，室温下4000 r/min离心15 min，分离血清与血浆，置于-20 ℃冰箱，待测。采用实时荧光定量PCR法(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测血浆miR let-7b-3p相对表达量，Trizol试剂(赛默飞飞世尔)提取的血浆中的总RNA，将2 μg的总RNA添加至20 μL反应液中，采用PrimeScript逆转录酶(宝生物工程(大连)有限公司)反向转录合成cDNA；PCR扩增。反应条件为：94 ℃ 5 min(变性)，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 30 s，35个循环(延伸)。miR let-7b-3p正向：5′-CUAUAUAGCCUACUGCCUUCCU-3′，反向：5′-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3′；GAPDH正向：5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，反向：5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt表示miR let-7b-3p相对表达量。

1.3 随访术后通过电话随访或复诊等方式随访，记录患者入院治疗后90 d内预后情况。采用改良Rankin量表(modified rankin scale,mRS)评分评估患者预后情况：患者无功能受限症状为0分；患者有功能受限症状，但能完成所有工作及日常生活为1分；轻度残疾，不能完成以前所有活动，但能独自处理个人事务记为2分；中度残疾，需他人协助才能完成日常生活，可独立行走为3分；中重度残疾，他人协助下可完成日常生活，但不能独立行走为4分；重度残疾，完全失去生活自理能力为5分；死亡为6分。mRS<3分为预后良好，mRS≥3分为预后不良。

1.4 统计学方法采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析。服从正态分布的计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料用频数和百分比[n(%)]表示，采用卡方检验。用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR let-7b-3p、模型A(出血转化、ONT、同型半胱氨酸)、模型B(出血转化、ONT、同型半胱氨酸、miR let-7b-3p)评估急性缺血性脑卒中患者预后的价值。用logistic回归分析影响急性缺血性脑卒中患者预后的相关因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性缺血性脑卒中患者预后情况355例急性缺血性脑卒中患者出院后3个月内预后不良发生率为45.07%(160/355)。死亡15例(4.23%)，重度残疾36例(10.14%)，中重度残疾50例(14.08%)，中度残疾59例(16.62%)。

2.2 两组基线资料比较根据患者预后情况将患者分为预后不良组(n=160)和预后良好组(n=195)。两组在年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、冠心病方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)；在出血转化、病灶数目、白介素-10、ONT、TOAST病因学分型、同型半胱氨酸、糖化红蛋白、D-二聚体、let-7b-3p方面比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组基线资料比较

表1续表

2.3 影响急性缺血性脑卒中患者预后的因素将出血转化(否=0，是=1)、病灶数目(单发=0，多发=1)、白介素-10、ONT、TOAST病因学分型(小动脉粥样硬化性、心源性栓塞、病因未明确=0，大动脉粥样硬化性=1)、同型半胱氨酸、糖化红蛋白、D二聚体、let-7b-3p作为自变量，α入=0.05，α出=0.10，将急性缺血性脑卒中患者预后情况作为因变量纳入logistic回归分析，结果显示出血转化、ONT、同型半胱氨酸及let-7b-3p与急性缺血性脑卒中患者预后密切相关，见表2。

表2 影响急性缺血性脑卒中患者预后的logistic多因素分析

2.4 miR let-7b-3p、模型A及模型B预测急性缺血性脑卒中患者预后的效能利用logistic回归分析建立出血转化、ONT、同型半胱氨酸预测急性缺血性脑卒中患者预后的模型：F=-7.544+0.494×Hcy+0.015×ONT+0.823×出血转化，将其命名为模型A；出血转化、ONT、同型半胱氨酸、miR let-7b-3p预测急性缺血性脑卒中患者预后的模型：F=-15.886+0.438×Hcy+0.012×ONT+1.323×出血转化+18.512×miR let-7b-3p，将其命名为模型B。miR let-7b-3p预测急性缺血性脑卒中患者预后的AUC高于模型A(Z=2.982，P=0.003)，模型B预测急性缺血性脑卒中患者预后的AUC高于miR let-7b-3p及模型A(Z=2.960，P=0.003；Z=6.082，P<0.001)，见表3。

表3 miR let-7b-3p、模型A及模型B预测急性缺血性脑卒中患者预后的效能

图1 miR let-7b-3p、模型A及模型B预测急性缺血性脑卒中患者预后的ROC曲线

3 讨论

急性缺血性脑卒中是临床常见的脑血管疾病，近年来其发病率逐年升高。急性缺血性脑卒中的最佳治疗时间是在发病后4.5 h之内，若未能及时接受治疗则会导致患者偏瘫或死亡。及早评估急性缺血性脑卒中患者预后情况并采取干预措施对改善患者预后至关重要。此前有临床研究[8]利用血清学指标如中性粒细胞/淋巴细胞比值等预测急性缺血性脑卒中患者预后情况，但其特异度较低，临床价值有限，其原因可能与中性粒细胞/淋巴细胞比值易受外界因素如炎症性疾病的影响，造成其浓度升高，导致特异性降低。miR let-7b-3p作为微RNA家族一员，可在血浆中稳定存在，个体间差异较小。基础研究[9]证实，miR let-7b-3p可在急性缺血性脑卒中大鼠血浆中表达升高，但未探究其与急性缺血性脑卒中患者预后的关系。因此本研究对其进行探讨。

相关研究[10]证实缺血性脑卒中患者let-7b表达低于健康人群，并且let-7b被证实在缺血性脑卒中的病理进展过程中发挥重要作用，因此认为let-7b在与缺血性脑卒中患者的预后可能存在联系。通过对患者进行随访观察，了解患者预后情况，并比较不同预后患者血浆miR let-7b-3p相对表达量，结果发现预后不良组患者血浆miR let-7b-3p相对表达量高于预后良好组，表明血浆miR let-7b-3p可能与患者预后存在联系。先前的研究[11]证实let-7b可激活toll-like受体(toll-like receptor，TLR)，而该受体为神经元细胞上TLR7的激活剂，可促进神经元细胞的凋亡，缺血性脑卒中患者预后不良可能与其该途径存在联系，但尚需进一步探究。为进一步明确miR let-7b-3p与急性缺血性脑卒中患者预后的关系，本研究采用Logistic回归分析影响急性缺血性脑卒中患者预后的因素，结果显示出血转化、ONT、同型半胱氨酸与急性缺血性脑卒中患者预后密切相关，结果与既往研究[12]相符。此外，本研究结果显示miR let-7b-3p与急性缺血性脑卒中患者预后密切相关。

热休克蛋白70的异常表达与急性缺血性脑卒中的发生、发展关系密切[13]。热休克蛋白70是一种高度保守的应激性蛋白，其基因定位于人1、5、6、9、11及14号染色体上，生理条件下，热休克蛋白70表达较低，在受到缺血、缺氧刺激后其表达增多，并且热休克蛋白70的核苷酸替换、缺失或插入突变可调节启动子的功能或转录活性，引起下游基因表达异常，导致急性缺血性脑卒中的发生[14]。此外，侧翼区核苷酸的改变则可影响热休克蛋白70的表达和稳定性，从而调节急性缺血性脑卒中的易感性[15]。动物实验表明，miR let-7b-3p可调节热休克蛋白的表达。因此，笔者推测miR let-7b-3p可能通过调节热休克蛋白70的表达参与急性缺血性脑卒中的疾病进展。

本研究同时构建了miR let-7b-3p、模型A及模型B预测急性缺血性脑卒中患者预后的ROC曲线，结果显示模型B预测患者预后的效能高于miR let-7b-3p及模型A，表明增加miR let-7b-3p更有利于预测急性缺血性脑卒中患者的预后。

综上所述，血浆miR let-7b-3p与急性缺血性脑卒中患者预后关系密切，检测血浆miR let-7b-3p表达情况有助于评估患者预后。本研究存在一定不足，下一将动态检测血浆miR let-7b-3p表达并进行基础研究，分析miR let-7b-3p影响急性缺血性脑卒中患者预后的病理生理机制。