PHF19对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

刘瑞芳，张志迪，陈梦茜，金在顺

(牡丹江医学院基础医学院病理学与病理生理学教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率一直居高不下，病理类型以鳞状细胞癌最常见[1-2]。锌指蛋白19(PHD finger protein 19,PHF19)，是多梳抑制复合体2(Polycomb repressive complex2,PRC2)的重要成员之一，定位于人类染色体9q33.2[3]。有研究认为PHF19能够通过自身Tudor结构域结合于H3组蛋白36位的赖氨酸残基，参与染色体活化[4]，并在多种癌症中发挥促癌作用。有实验研究表明了[5]，PHF19在宫颈癌Hela细胞中高表达，siRNA干扰PHF19表达后，Hela细胞增殖抑制并且凋亡增加。因此，本文欲探讨PHF19的表达对宫颈癌不同分化程度的细胞(Hela细胞和HCC94细胞)增殖、侵袭和迁移的影响，为寻找宫颈癌临床潜在治疗靶点提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人宫颈癌Hela细胞株购自吉凯公司；人宫颈癌HCC94细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM培养基购自上海立菲生物科技有限公司；胎牛血清购自以色列BI生物科技公司；胰酶购自上海碧云天生物技术有限公司；siRNA试剂盒购自广州锐博生物有限公司；CCK-8试剂盒购自赛国(中国)生物科技有限公司；RNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；逆转录试剂盒购自Roche公司；SYBR Green Tap Ready Mix购自美国Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Hela细胞株、HCC94细胞株常规复苏，加入含有10% FBS的DMEM培养基，放入37 ℃、5%的CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行后续实验。根据细胞生长情况，进行换液，传代，冻存等。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖能力 取对数期生长的Hela细胞和HCC94细胞，按每孔2×105个细胞接种于3个96孔板，培养24 h后，根据转染试剂说明书，按照siRNA-2-50浓度，进行siRNA转染，每组设置3个复孔。分别培养24 h、48 h、72 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱孵育4 h，酶标仪测定在450 nm处的吸光值。细胞活力(%)=(siRNA组-空白组)/(对照组-空白组)。

1.2.3 RT-qPCR检测PHF19的mRNA表达 按照E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit说明书从培养的细胞中提取总RNA，并用NANODROP测定RNA浓度及纯度。根据Roche逆转录试剂盒说明书将上述提取的RNA逆转录为cDNA。利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)完成扩增，反应条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸50 s；进行40个循环；72 ℃延伸5 min，收集数据。每个样本重复3次，利用2-ΔΔCT法计算各样本mRNA的相对表达量。引物序列见表1、反应体系见表2。

表1 RT-qPCR引物扩增序列

表2 RT-qPCR反应体系

1.2.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 培养Hela细胞和HCC94细胞于六孔板中，每孔种3×105个细胞，以未做任何处理组为Hela组和HCC94组、按照转染试剂说明书通过siRNA-2-50(转染试剂说明书中给出的转染浓度)浓度进行转染处理的组为siRNA-2-50组、以siRNA-NC转染处理组为NC组，待各组细胞贴壁后，用10 μL移液器枪头对每孔内划3条直线，吸净培养基，PBS轻轻冲洗两次用倒置显微镜拍照，加入siRNA转染，继续培养，于12 h、24 h处用倒置显微镜拍照。

1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭能力 培养Hela细胞和HCC94细胞于24孔板，每孔种2×105个细胞，以未做任何处理组为Hela组和HCC94组、按照转染试剂说明书通过siRNA-2-50浓度转染处理组为siRNA-2-50组、以siRNA-NC转染处理组为NC组，胰蛋白酶常规消化，用无血清培养基重悬细胞浓度为1×106/mL，Transwell小室铺Matrigel胶后于培养箱放置1 h，于上室加细胞悬液200 μL，下室加10% FBS 600 μL，培养24 h，第二天PBS冲洗，甲醇固定再冲洗，结晶紫染色后冲洗，显微镜拍照。

1.3 统计学分析应用GraphPad Prism 7.0统计软件，计量资料以“均数±标准差”表示，两组间差异性比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA作用后Hela细胞和HCC94细胞中PHF19的mRNA表达减少RT-qPCR实验结果表明，siRNA作用后与Hela组和HCC94组相比，siRNA-2-50组中PHF19 mRNA的水平表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

图1 siRNA处理后PHF19基因mRNA的相对表达

2.2 siRNA作用后Hela细胞和HCC94细胞增殖活性降低CCK-8检测结果说明，siRNA作用24 h、48 h、72 h后，对比Hela组和HCC94组，siRNA-2-50组细胞增殖活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

图2 siRNA处理后细胞的存活率

2.3 siRNA作用后Hela细胞和HCC94细胞迁移能力降低细胞划痕实验检测结果表明，与对照组相比，siRNA作用24 h后，siRNA-2-50组细胞的迁移能力明显受到抑制，且差异有统计学意义(P<0.01)(见图3)。

图3 siRNA干扰后细胞的迁移能力

2.4 siRNA作用后Hela细胞和HCC94细胞侵袭能力降低Transwell实验检测证实了，siRNA作用24 h后，对比Hela组和HCC94组，siRNA-2-50组细胞的侵袭能力降低，差异有统计学意义(见图4)。

图4 siRNA作用后细胞的侵袭能力(×100)

3 讨论

多梳蛋白家族(Polycomb group protein,PcG)是一类在染色质水平上以表观遗传修饰方式调控靶基因的转录因子，通常以PRC的形式存在[6]，在细胞分化、维持细胞特性等多种方面存在至关重要的作用，目前探讨较多的是PRC1和PRC2[7]。PHF19是PRC2中的主要成员之一，参与了多种疾病的发生发展[8-9]。近年来，许多研究表明PHF19在多种癌症都发挥促癌作用，包括皮肤癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌和结肠癌等。

Tao F等[10]研究证明MALAT1/miR-211/PHF19调节轴参与了卵巢癌的发病，促进了卵巢癌的增殖和迁移。Hu H[4]等有研究表明，PHF19的促进肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖。WANG H[11]等研究表明，PHF19在胃癌组织中表达上调，可促进胃癌细胞的增殖和迁移。由此，我们猜测PHF19作为癌基因也可能在宫颈癌中发挥促癌作用，本课题组之前已经研究证实了[5]PHF19在宫颈癌低分化Hela细胞中高表达，可促进宫颈癌Hela细胞增殖，抑制凋亡，Hela细胞为宫颈癌常用细胞系。因此，我们猜测PHF19是否在宫颈癌高分化细胞(HCC94)中也存在高表达，并且PHF19基因是否可以调节宫颈癌的侵袭和迁移能力。

为探究PHF19对宫颈癌细胞的具体影响，我们首先对人宫颈癌不同细胞系(Hela细胞和HCC94细胞)进行siRNA干扰，通过qRT-PCR技术检测显示，进行siRNA转染的细胞中PHF19 mRNA的表达量明显低于对照组细胞，且在统计学上有显著意义，证明siRNA成功干扰PHF19的表达。我们进行了CCK-8实验检测PHF19对宫颈癌Hela细胞和HCC94细胞增殖活力的影响，对siRNA-2-50组、正常对照组、阴性对照组细胞进行24 h、48 h、72 h的培养后，CCK-8结果均显示，在siRNA干扰PHF19的表达后，Hela和HCC94细胞的增殖能力均明显减低。为了观察PHF19对宫颈癌不同细胞系侵袭、迁移能力的影响，我们分别进行了细胞划痕实验、Transwell侵袭实验。划痕实验证实，siRNA处理24 h后，Hela细胞和HCC94细胞的迁移能力明显受到抑制；Transwell实验同样验证了PHF19可以促进宫颈癌不同细胞系的侵袭能力。

综上所述，在本研究中PHF19在宫颈癌不同分化程度的细胞系中高表达，但PHF19与宫颈癌不同恶性程度是否存在关系，尚未可知，需要我们进一步实验证实。通过siRNA干扰PHF19的表达，我们发现PHF19在宫颈癌中作为促癌基因，促进宫颈癌细胞的增殖及侵袭迁移能力。但是肿瘤的发生进展是一个较为复杂的过程，受多种细胞因子调控[12]，其促进宫颈癌发展进程的具体相关机制尚未得到明确研究。一些研究结果显示，PHF19可以影响AKT和ERK的活性，AKT和ERK是两个信号通路中的两个关键激酶。此外，PHF19基因敲除可能通过降低AKT和ERK信号活性而强烈抑制胃癌细胞的增殖和迁移，提示AKT和ERK信号可能介导PHF19在癌症中的作用[13]。在此背景下，我们可以猜测PHF19在宫颈癌中是否也可以通过介导对AKT和ERK信号的调控来影响宫颈癌增殖和侵袭迁移的发生机制，这值得我们在未来进一步研究阐明。