HPLC-ELSD 法同时测定舒血宁注射液中4 种银杏内酯

胡梦婷，王若柳，佟美鸿，康 宁，王书芳*

（1.浙江大学药学院，浙江 杭州 310058；2.黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，黑龙江 虎林 158400）

舒血宁注射液是银杏叶经过提取、柱层析等工艺过程制成的中药注射剂，功能主治扩张血管、改善微循环［1]，银杏内酯是其药效物质［2-6]，对中枢神经系统［7]、心脑血管的缺血性损伤［8]均具有保护作用，但该成分紫外吸收很弱，目前大多采用HPLCELSD 或LC-MS 法测定银杏内酯A、B、C、白果内酯含量［9-13]，另有报道采用HPLC-Q-TOF-MS 法测定银杏种子、银杏叶、银杏根皮中银杏内酯A、B、C、J、白果内酯的含量［14]，但相关仪器价格昂贵，而且质谱检测器的重复性不如紫外检测器、蒸发光散射检测器，不适合生产过程中的日常检验。

课题组前期研究发现，舒血宁注射液中除了银杏内酯A、B、C 外，还含有一定量银杏内酯J，故本实验在《舒血宁注射液国家药品标准》 的基础上增加了该成分含量测定。舒血宁注射液原质量标准中的样品前处理方法是用2 mL 丙酮进行复溶，但该溶剂挥发性强，而且属于第三类易制毒品，购买不便，因此改成5 mL 甲醇，然后建立HPLCELSD 法同时测定其中银杏内酯A、B、C、J 的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配置四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、蒸发光散射检测器、Chemstation 工作站控制系统；AE 240 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AG22331 型离心机（德国Eppendorf公司）；Millipore 超纯水器（美国Millipore 公司）。

银杏内酯A（批号 100086-201612，纯度97.4%）、银杏内酯B（批号110863-201611，纯度95.6%）、银杏内酯C（批号110864-201508，纯度99.8%）对照品，均购自中国食品药品检定研究院；银杏内酯J 对照品（批号Z12S8X41702，纯度98%），购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇为色谱纯，购自德国Merck 公司；乙酸乙酯、无水乙酸钠、四氢呋喃均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；盐酸为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司；去离子水，由Milli-Q 超纯水系统过滤得到。

舒血宁注射液由A 公司提供，其中A 厂家2 mL的10 批，5 mL 的13 批；B 厂家2 mL 的1批，5 mL 的7 批；C 厂家5 mL 的1 批；D 厂家5 mL的7 批；E 厂家2 mL 的3 批，5 mL 的4 批；F 厂家5 mL 的14 批；G 厂家5 mL 的14 批；H 厂家2 mL 的1 批，共75 批。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇-四氢呋喃-水（20∶10∶75）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。蒸发光散射检测器参数为漂移管温度65 ℃；增益7；气速3 bar（1 bar=100 kPa）。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J 对照品适量，甲醇制成每1 mL 分别含四者0.946 0、0.836 0、0.830 0、0.929 0 mg 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密量取舒血宁注射液15 mL，加稀盐酸2 滴，调节pH 值至2，乙酸乙酯萃取4 次，体积分别为20、10、10、10 mL，合并乙酸乙酯层，20 mL 5%醋酸钠溶液洗涤，取乙酸乙酯层，醋酸钠溶液再以10 mL 乙酸乙酯洗涤，合并乙酸乙酯液，20 mL 水洗涤2 次，合并乙酸乙酯，蒸干后甲醇复溶并定容至5 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 专属性试验 取空白溶剂及对照品、供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，见图1。由此可知，各银杏内酯附近无其他成分干扰，分离度良好。

图1 各银杏内酯HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of variouis constituents

2.4 线性关系考察 精密吸取不同质量浓度的对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积的对数为纵坐标（Y），对照品质量浓度的对数为横坐标（X）进行回归，结果见表1，可知各银杏内酯在各自范围内线性关系良好。

表1 各银杏内酯线性关系Tab.1 Linear relationships of various ginkgolides

2.5 方法学考察

2.5.1 重复性试验 取同一批舒血宁注射液，由同一操作人员按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得银杏内 酯J、C、A、B 含量RSD 分别 为3.9%、4.0%、2.8%、3.5%，表明该方法重复性良好。

2.5.2 精密度试验 取同一批舒血宁注射液，由不同操作人员按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得银杏内酯J、C、A、B 含量RSD 分别为2.1%、4.3%、3.7%、3.2%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一批舒血宁注射液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下于24 h内在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得银杏内酯J、C、A、B 峰面积RSD 分别为3.3%、2.4%、2.3%、3.0%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 精密量取各银杏内酯含量已知的同一批舒血宁注射液（厂家A），分别按约50%、100%、150%水平精密加入对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备低、中、高质量浓度供试品溶液各3 份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各银杏内酯加样回收率试验结果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests for various ginkgolides（n=9）

2.8 样品含量测定 吸取8 个厂家75 批舒血宁注射液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，平行2 次，计算含量，结果见表3。

表3 各银杏内酯含量测定结果（n=2）Tab.3 Results of content determination of various ginkgolides（n=2）

3 讨论

本实验检测了8 个厂家75 批舒血宁注射液中4 种银杏内酯的含量，发现不同厂家各银杏内酯含量差异较大，RSD 18.4%～28.0%，在同一厂家中，A、E 厂家RSD分别 为7.2%～11.8%、4.9%～11.6%，质量一致性较好；银杏内酯J 含量占总银杏内酯含量的比例为3.7%～15.9%。究其原因，可能是由于不同厂家所用银杏叶的产地批次不同，工艺也有所差别，同时内酯类成分稳定性差，也导致其含量存在一定的波动。此外，现行国家药品标准只规定了舒血宁注射液中银杏内酯A、B、C 及三者总和的最低含量，过于宽泛，厂家难以严格控制，故建议增加银杏内酯含量上限规定，以期进一步提升该制剂的批次一致性。

4 结论

本实验建立HPLC-ELSD 法同时测定舒血宁注射液中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J 的含量，发现该方法重复性、准确度较好，但不同厂家各银杏内酯含量差别较大，故有必要提高质量标准以保证产品批次一致性。