复方臭灵丹合剂提取工艺的优化及质量评价

付 鹏余晓玲袁小淋*陈凌云

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，云南昆明 650500；3.昆明市中医医院，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染是以咳嗽、咽痛、发热等为主要症状，与细菌或病毒感染有关的疾病［1]，目前临床大上多采用广谱抗病毒药物进行治疗，但效果一般，并存在一定的不良反应［2]。复方臭灵丹合剂由臭灵丹、鱼腥草、西青果、滇柴胡、桔梗5 味中药组成，具有清热解毒、祛痰止咳等功效，方中臭灵丹主要含洋艾素等黄酮类成分［3]，鱼腥草中金丝桃苷具有抑菌等作用［4]，西青果主要含有的多酚具有抗炎、抗菌作用［5]，滇柴胡、桔梗有效成分也对细菌、病毒有抑制作用［6-7]。

控制复方臭灵丹合剂中主要活性成分的提取率是中药制剂质量的关键步骤［8-11]，其变化与临床疗效密不可分［12]，同时多指标的综合评价对最优工艺参数有直接影响［13]。因此，本实验将通过Box-Benhnken 响应面法结合信息熵对复方臭灵丹合剂中没食子酸、金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素、绿原酸提取工艺进行优化，并以没食子酸为内标，建立一种快速简便的一测多评法来测定各成分含量［14-15]，以期为该方质量控制的标准化和现代研究提供科学依据。

1 材料

Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；15-LC 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB265-S 电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SK2200HP 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）。

没食子酸（批号110756-201512，纯度≥98%）、绿原酸（批号110809-201205，纯度≥98%）、金丝桃苷（批号111521-201204，纯度≥93.9%）、槲皮素（批号112345-20190930，纯度≥98%）、异鼠李素（批号110860-201611，纯度≥99.8%）、洋艾素（批号111879-201102，纯度≥97.2%）对照品（中国食品药品检定研究院）。复方臭灵丹合剂（昆明市中医医院）。乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC 测定6 种成分含量

2.1.1 对照品溶液制备 取没食子酸、金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素、绿原酸对照品适量，甲醇溶解定容至刻度，即得（各成分质量浓度分别为408.5、300.7、152.0、20.1、70.5、604.0 μg/mL）。

2.1.2 供试品溶液制备 精密吸取复方臭灵丹合剂25 mL，在固定料液比下用固定体积分数甲醇超声提取固定时间，水浴蒸干，甲醇定容至5 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 DIKMA Diamonsil-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～8 min，2%～3%A；8～10 min，3%～10%A；10～20 min，10%～16%A；20～25 min，16%～18%A；25～30 min，18%～20%A；30～40 min，20%～39%A；40～60 min，39%～60%A；60～65 min，60%～65% A；65～72 min，65%～73%A）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长360 nm（金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素）、325 nm（绿原酸）、270 nm（没食子酸）；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 线性关系考察 吸取“2.1.1”项下对照品溶液，逐步稀释，在“2.1.3”项色谱条件下各进样10 μL 测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度试验 精密吸取“2.1.1”对照品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定6 次，测得没食子酸、金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素、绿原酸峰面积RSD 分别为0.33%、0.41%、0.37%、0.66%、0.14%、0.54%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素、绿原酸峰面积RSD 分别为1.19%、1.45%、1.77%、1.41%、0.79%、1.02%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批合剂，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素、绿原酸峰面积RSD 分 别 为 0.52%、0.47%、1.26%、1.25%、1.06%、1.26%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的同一批合剂，精密加入等量对照品溶液，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素、绿原酸平均加样回收率分别为101.42%、10.2.23%、101.12%、99.58%、101.21%、102.33%，RSD 分别为0.23%、1.77%、1.68%、1.51%、1.27%、1.51%。

2.2 单因素试验 参考文献［16-17] 报道，固定提取时间10 min、甲醇体积分数50%，考察料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）对提取工艺的影响，再依次考察不同提取时间（10、15、30、45 min）、甲醇体积分数（50%、60%、80%、100%）。结果，最优提取工艺为料液比1∶8，提取时间30 min，甲醇体积分数80%。

2.3 Box-Behnken 响应面法 以料液比（A）、提取时间（B）、甲醇体积分数（C）为影响因素，没食子酸、金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素、绿原酸含量的综合评分为评价指标，Box-Behnken响应面法优化提取工艺，因素水平见表2，结果见表3。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 试验设计与结果Tab.3 Design and results of tests

以没食子酸、金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素、绿原酸含量为评价指标，用公式Pij=对表3 数据进行处理，建立概率矩阵（Pij）mn，再分别用公式计算各指标信息熵Hij=［0.999 1，0.987 5，0.995 9，0.992 6，0.993 1，0.997 5]、权重系数Wi=［2.52%，36.68%，11.84%，21.54%，20.20%，7.22%]，最后计算综合评分M，公式为M=（没食子酸含量/最大值）×W1+（金丝桃苷含量/最大值）×W2+（槲皮素含量/最大值）×W3+（异鼠李素含量/最大值）×W4+（洋艾素含量/最大值）×W5+（绿原酸含量/最大值）×W6。

通过Design-Expert 8.0.6 软件对表3 数据进行二次多元回归拟合分析，得方程为M=92.19+4.56A+3.74B+4.90C+3.96AB+6.87AC+5.79BC-8.50A2-17.80B2-8.42C2（R2=0.954 0），方差分析见表4，可知模型P＜0.05，失拟项P=0.709 8＞0.05，表明模型有效；因素A、C、AC、BC、A2、B2、C2对综合评分有明显影响（P＜0.05），响应面分析见图2。最终确定，最优提取工艺为料液比1∶9，提取时间34 min，甲醇体积分数92%，综合评分为95.54 分。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

按优化工艺进行3 批验证实验，结果见表5，可知该工艺稳定可行。

表5 验证试验结果（n=3）Tab.5 Results of verification tests（n=3）

2.4 一测多评法测定6 种成分含量

2.4.1 相对校正因子计算 由于没食子酸含量较高、色谱峰稳定，故选择其作为内标，计算其他5种成分的相对校正因子f，计算公式为f=fk/fs=（CkAs）/（CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表6。

表6 各成分相对校正因子Tab.6 Relative correction factors of various constituents

2.4.2 耐用性考察

2.4.2.1 仪器、色谱柱 本实验考察了Agilent 1100、岛津15LC 色谱仪，以及Agilent XDB-C18、DIKMA Diamonsil-C18、OMNI Zinger-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对相对校正因子的影响，结果见表7，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表7 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.7 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.4.2.2 柱温 固定其他色谱条件不变，本实验考察了柱温20、25、30、35、40、45 ℃对相对校正因子的影响，结果见表8，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表8 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.8 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.4.2.3 体积流量 固定其他色谱条件不变，本实验考察了体积流量0.5、0.7、0.8、1.0、1.1、1.2 mL/min 对相对校正因子的影响，结果见表9，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表9 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.9 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.4.3 色谱峰定位 采用相对保留时间法，分别考察内标、其他成分在不同仪器、色谱柱、柱温、体积流量下的相对保留时间，发现均无明显差异（RSD＜5.0%）。

2.4.4 样品含量测定 取10 批合剂，分别采用一测多评法、外标法计算各成分含量，结果见表10，可知2 种方法无明显差异（RSD＜5.0%）。

表10 各成分含量测定结果（%，n=3）Tab.10 Results of content determination of various constituents（%，n=3）

3 讨论

本实验首次采用Box-Benhnken 响应面法结合信息熵对复方臭灵丹合剂中6 种成分提取工艺进行优化，有利于兼顾各指标之间的协同效应，符合中药复方多成分、多靶点的特点及中医用药的整体观。然后通过信息熵来评价各指标权重系数，在保持其稳定性的同时可更好地区分数据信息，进而筛选出最佳工艺，提高了实验结果的严谨性和科学性。

没食子酸、绿原酸分别在270、325 nm 波长处有最大吸收，而金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素在360 nm 波长处有最大吸收。本实验比较了上述3 个波长处的色谱图，发现270 nm 下只能检测到没食子酸，325 nm 下只能检测到绿原酸，360 nm下只能检测到金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、洋艾素，故最终采用多波长同时扫描。

一测多评法依据中药有效成分之间存在某些内在关系的特性，只需测定某一内标即可计算其他成分含量［18]。由于没食子酸化学性质稳定，含量高，价格低廉，相对校正因子稳定，故本实验选择其作为内标来准确测定其他成分含量，体现了一测多评法的特点。