一测多评法同时测定五苓胶囊中8 种成分

苏凤芹，陈 卫，陈秀娟，吴慧炜，孙铭军，陈海燕

（1.济南市人民医院药剂科，山东 济南 271199；2.莱芜职业技术学院医学技术与护理系，山东 济南 271100；3.广西卫生职业技术学院药学系，广西 南宁 530023）

五苓胶囊由泽泻、茯苓、猪苓、肉桂、麸炒白术5 味中药加工而成，收载于2020 年版《中国药典》 一部［1]，具有利尿、增强免疫、保护肝脏、抗肿瘤、抗辐射等作用，可明显降低高血压病患者动脉血压及血尿酸水平［2-3]，联合培哚普利可改善临床症状［4]；增强良性前列腺增生症术后膀胱逼尿肌收缩力，显著改善排尿障碍［5]，减轻早期糖尿病肾病患者肾小球及肾小管损伤［6]；降低前列腺癌患者血清中微小核糖核酸-141 表达［7]；改善抗精神病药物引起水肿［8]等。但五苓胶囊现行质量标准［1，9]仅对方中肉桂所含桂皮醛进行定量控制，而中成药复方制剂是多种成分的集合体，按照中医配伍君臣佐使理论相互协调制约，从而达到整体临床疗效。因此，本实验采用一测多评法同时测定五苓胶囊中猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 的含量，以期为提高该制剂质量标准、全面评价其整体质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；FA2004 型电子天平（德国Sartorius 公司）；KQ-500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 白术内酯Ⅲ（批号111978-201501，纯度 99.9%）、白术内酯Ⅰ（批号111975-201501，纯度99.9%）、23-乙酰泽泻醇B（批号111846-201705，纯度99.7%）对照品，均购自中国食品药品检定研究院；24-乙酰泽泻醇A（批号PRF8050342，纯度99.7%）、猪苓酮B（批号 PRF8070404，CAS 号 141360-89-6，纯度98.6%）、猪苓 酮A（批号PRF8081143，纯度97.3%）对照品，均购自成都普瑞法科技开发有限公司；泽泻醇F 对照品（批号CFS201701，纯度98.0%），购自武汉天植生物技术有限公司；泽泻醇A 对照品（批号15071422，纯度97.9%），购自上海同田生物技术股份有限公司。五苓胶囊（每粒装0.45 g，批号190203、190413、190604），购自江西品信药业有限公司。乙腈为色谱纯，购自天津市彪仕奇科技发展有限公司；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 对照品适量，甲醇制成各成分质量浓度分别为0.854、0.378、0.536、0.492、0.158、0.344、0.212、1.196 mg/mL 的贮备液，各精密吸取2.5 mL，甲醇定容至50 mL，即得（各成分质量浓度分别为42.7、18.9、26.8、24.6、7.9、17.2、10.6、59.8 μg/mL）。

2.1.2 供试品溶液 取胶囊10 粒，倾出内容物，研细，取约0.5 g，精密称定，精密加入25 mL甲醇，称定质量，超声提取45 min，放冷，甲醇补足减失的质量，滤过，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按2020 年版《中国药典》一部五苓胶囊质量标准项下的工艺处方，分别制备缺猪苓、缺白术、缺泽泻的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件及专属性试验 Agilent Polaris C18-A色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～9.0 min，25.0%A；9.0～ 17.0 min，25.0%～ 43.0% A；17.0～29.0 min，43.0%～55.0% A；29.0～44.0 min，55.0%～78.0% A；44.0～50.0 min，78.0%～25.0%A）；体积流量0.9 mL/min；柱温25 ℃；检测波长248 nm（0～17.0 min，猪苓酮B、猪苓酮A）［10]、220 nm（17.0～29.0 min，白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ）［11-13]、208 nm（29.0～50.0 min，泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B）［14-15]；进样量10 μL。精密吸取“2.1.1”至“2.1.3”项下各溶液，在上述色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰峰形对称，分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分色谱峰计均不低于4 500，阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，甲醇稀释至20 mL，制成6 个质量浓度，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 8 种成分线性关系Tab.1 Linear relationships of eight constituents

2.3.2 精密度试验 取“2.1.1”项下对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定6 次，测得猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 峰面积RSD 分别为0.67%、0.95%、0.79%、0.83%、1.18%、1.01%、1.07%、0.56%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批胶囊，按“2.1.2”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 含量RSD 分别为1.03%、1.36%、1.20%、1.17%、0.84%、1.69%、0.78%、0.99%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、12、16 h 在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 峰面积RSD 分别为0.71%、0.92%、0.80%、0.85%、1.19%、0.98%、1.04%、0.59%，表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的同一批胶囊细粉约0.25 g，精密称定，共9 份，按2020年版《中国药典》 四部要求，精密加入对照品溶液（猪苓酮B 0.496 mg/mL、猪苓酮A 0.212 mg/mL、白术内酯Ⅲ0.358 mg/mL、白术内酯Ⅰ0.284 mg/mL、泽泻醇F 0.088 mg/mL、泽泻醇A 0.192 mg/mL、24-乙酰泽泻醇A 0.116 mg/mL、23-乙酰泽泻醇B 0.684 mg/mL）0.5、1.0、1.5 mL各3 份，水平分别约为50%、100%、150%，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 平均加样回收率（RSD）分别为100.06%（0.78%）、98.69%（0.91%）、98.93%（1.16%）、99.27%（0.97%）、96.99%（1.25%）、97.92%（1.47%）、97.73%（1.33%）、100.01%（0.65%）。

2.4 相对校正因子计算 采用多点校正法，取“2.3.1”项下不同质量浓度对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，以白术内酯Ⅰ为内标，计算其他7 种成分的相对校正因子f，公式为f=fk/fs=（CkAs）/（CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性考察

2.5.1 仪器、色谱柱 取“2.1.1”项下对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，考察Waters 2695、Agilent 1200 色谱仪，以及Agilent Polaris C18-A、Topsil C18、Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 柱温 取“2.1.1”项下对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，考察柱温20、22、25、28、30 ℃）对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表4 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.5.3 体积流量 取“2.1.1”项下对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，考察体积流量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min 对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表5 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.6 色谱峰定位 取“2.1.1”项下对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，以白术内酯Ⅰ为基准峰，采用相对保留时间法，在“2.5.1”项仪器、色谱柱下对色谱峰进行定位，结果见表6，可知均无明显差异（RSD＜5.0%）。

表6 各成分相对保留时间Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.7 样品含量测定 取3 批胶囊，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每批平行3 份，在“2.2”项色谱条件下进样测定，分别采用一测多评法、外标法计算各成分含量，结果见表7，可知2 种方法无明显差异［相对平均偏差（RAD）＜5.0%]。

表7 各成分含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.7 Results of content determination of various constituents（mg/g，n=3）

3 讨论

五苓胶囊中泽泻功效利水渗湿、泄热化浊，为君药；猪苓、茯苓加强利水渗湿之功，合为臣药；白术功效健脾益气、燥湿利水，为佐药；肉桂功效补火助阳、引火归元，为使药，诸药合用，共奏温阳化气、利湿行水之功。本实验参考中药质量标志物确定原则［16-17]，选取泽泻主要药效成分泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B，猪苓特征成分猪苓酮B、猪苓酮A，白术代表性成分特征成分白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ作为五苓胶囊指标成分进行检测。

本实验以猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 的综合提取率为指标，对提取溶剂（95%乙醇［10]、甲醇［11，13]、水［12]、50%甲醇）、提取方式（加热回流提取、超声提取［10-15]）、提取时间（30、45、60 min）进行考察，最终确定甲醇超声提取45 min 作为供试品溶液制备方法。

4 结论

本实验首次采用一测多评法同时测定五苓胶囊中猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 的含量，该方法操作简便，结果准确，重复性好，有助于药品生产企业和监管部门不断完善该制剂质量控制标准，并为全面评价其内在质量、确保其临床疗效一致性提供依据。