胃癌组织中膜转铁蛋白及肽基脯氨酰顺反异构酶的阳性表达率与临床病理参数的关系

欧有冠，朱蕾，鲁才杰

胃癌在恶性肿瘤中十分常见，其发生率和致死率在国内常见肿瘤中均排名第2位，对患者的健康和生命安全带来极大的威胁和困扰[1]。根据2015年流行病学的统计数据，胃癌在国内年新发人数超过60万，死亡人数高达40多万，其发生率和致死率均排在了全部癌症中的第2位，因大部分患者在诊断时已发生了转移，5年生存率不到10%[2]。胃癌细胞的分裂增殖以及转移机制当前还未定论，缺乏对胃癌预后的预测指标，对胃癌的疗效影响十分严重[3]。相关研究发现，铁对于肿瘤细胞的分裂增殖具有促进作用，大多数肿瘤均表现出铁的供应量不足，一些可对铁代谢异常进行调节的蛋白表达可显著影响肿瘤细胞的分裂增殖及转移[4]。铁调素是近年来发现的一种蛋白质水解的中间产物，其可促进膜转铁蛋白(ferroportin,FPN)低表达和诱导其降解对铁代谢异常进行调节，故推测FPN可能在铁代谢中具有十分重要的调节作用。而肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidylprolyl cis-trans isomerase，PIN1)属于高度保守且特异的磷酸化异构酶，高表达于大多数类型的肿瘤中[5]。本研究对30例胃癌患者的肿瘤组织标本与10例胃癌患者的癌旁正常胃黏膜组织中PIN1、FPN的表达水平进行了测定，分析了2者与胃癌患者临床病理参数间的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集深圳市龙华区中心医院2017年2月至2020年2月手术切除的30例胃癌患者的存档胃部肿瘤组织蜡块，均经病理学检查确诊。其中，男20例，女10例，中位年龄55岁；TNM分期符合2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC)TNM分期标准[6]，T1、T2期13例，T3、T4期17例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移5例。另选取10例胃癌患者的癌旁正常胃黏膜组织作为对照。所有患者术前均未接受过放化疗，所有标本均由2名专家进行确认。

1.2 方法 胃癌组织和正常胃黏膜组织标本均经40 g/L多聚甲醛固定、石蜡包埋以及4～6 μm连续切片。PIN1兔抗多克隆IgG抗体购自北京博尔西科技有限公司，使用稀释液将抗体进行稀释，稀释度为1：50。免疫组化反应液、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。用PBS代替一抗作为空白对照，用购买的已知阳性切片作为阳性对照，操作严格按试剂盒说明书进行。所有组织经甲醛固定、石蜡包埋、苏木素—伊红染液(HE)染色后，在光学显微镜下相应找到其石蜡组织块上已标记的肿瘤组织，制作成10×16组织阵列(每个标本取2个芯点，直径1.6 mm)，共制作成3个蜡块。正常胃黏膜组织取自距肿瘤≥7 cm的胃黏膜组织。PIN1蛋白阳性表达主要定位于胞质，显示棕黄色为阳性。免疫组化反应结果判定方法：肿瘤组织或腺体组织超过芯片点的10%为有效病例。用同一标本癌组织阳性染色区域，进行不低于10个视野的观察，结果以100个细胞计算染色强度指数(staining intensity index, SII)：<6%为(-)，6%～25%为(+)，26%～50%为(++)，>50%为(+++)；(+)～(+++)均计为阳性。

1.3 统计学处理 应用SPSS 22.0软件进行统计分析，阳性表达率为计数资料，以百分比表示，行χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PIN1、FPN蛋白在正常胃黏膜与胃癌组织中的阳性表达率 FPN在正常胃黏膜组织中阳性表达率为80.0%(8例)，高于胃癌组织中的50.0%(15例)，差异有统计学意义(P<0.05)。PIN1在正常胃黏膜组织中阳性表达率为20.0%(2例)，低于胃癌组织中PIN1蛋白阳性表达率33.3%(10例)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 PIN1、FPN表达与胃癌组织临床病理参数的关系 30例胃癌组织标本中按患者年龄、性别、临床TNM分期分组中，PIN1蛋白阳性表达率比较差异均无统计学意义(P>0.05)；在肿瘤淋巴结转移有无分组中，PIN1蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)。在胃癌TNM分期分组中，FPN蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)，在年龄、性别、有无肿瘤淋巴结转移分组中，FPN蛋白阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 PIN1和FPN表达与胃癌组织临床病理参数的关系[例(%)]

3 讨论

PIN1是由人PIN1基因编码的一种对有丝分裂进行调节的蛋白，主要存在于细胞核中，其中包括一个核定位信号(nuclear localization signal, NLS)以及2个功能区域，功能区域其中一个为N端的色氨酸-色氨酸中心区WW,另一个是C端的PIN1 PPlase活性区[7]。相比其他肿瘤标志物，PIN1可催化癌变[8]。PIN1具有的2个相互独立结构区域，其中WW可与丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸(phosphor-Ser-Pro or phosphor-ThrPro, pSer/Thr-Pro)基序发生特异性结合，PIN1 PPlase活性区则可对底物异构产生催化作用。上述PIN1的2个独立结构区域协同合作对底物顺反异构产生催化作用，此种构象可对 PIN1多种底物蛋白的功能产生较大的影响。比如，真核细胞有丝分裂的关键激酶 Polo样蛋白质激酶1(polo-like kinase1,PLK1)和周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)以及2种酶的底物均与PIN1产生作用，通过这些作用，PIN1可对有丝分裂的时空产生影响。与pSer/Thr-Pro结构区域相结合，可改变磷酸化蛋白的构象，从而对其功能和稳定性产生影响[9]。

PIN1阳性表达于大量的肿瘤细胞质、细胞核，均呈现出不同的染色情况。本研究中在胃癌组织中PIN1蛋白阳性表达率高于正常胃黏膜组织，提示PIN1在胃癌的发生、进展过程中产生一定的影响。在与其临床病理参数的比较中，笔者发现在有无淋巴结转移分组中PIN1蛋白表达差异显著，与相关研究结果一致；但某些方面存在不一致性，笔者考虑原因在于PIN1抗体的分类号、稀释度、标本量、免疫组化反应结果判断标准等存在差异。

周期蛋白(cyclin)中的CyclinD1是细胞周期中与肿瘤关系紧密的癌基因。PIN1的目标蛋白超过20种，其中最受研究者关注的是CyclinD1，CyclinD1是细胞周期中的G1期相关蛋白，其基因和编码蛋白发生异常对肿瘤的产生和进展影响较大[10]。相关研究表明，CyclinD1是PIN1十分重要的作用目标蛋白之一，PIN1不但可促进CyclinD1转录，而且还可诱导CyclinD1从胞核转移至胞质中进行降解，使得CyclinD1高表达，促使乳腺上皮细胞转化增殖[11]。相关研究结果显示，PIN1在正常乳腺组织中阴性表达，只在乳腺癌组织中阳性表达。在PIN1高表达的60例乳腺癌中42例合并CyclinD1高表达，而在PIN1低表达的48例乳腺癌中仅有25例CyclinD1阴性表达，同时CyclinD1表达还与淋巴结转移存在一定的关系[12]。PIN1不管是激活Ras信号传导途径还是应激活化蛋白激酶(SAPK)，目标均是为了提升c-Jun的转录活性。另有研究发现，PIN1在人类乳腺癌组织中过表达，在正常乳腺上皮细胞和乳腺癌旁组织中呈现低表达，且其表达水平与乳腺癌临床病理分期存在相关性。国内研究者通过蛋白质体学在胃癌差异蛋白质研究中发现PIN1高表达[11]。本研究结果显示，胃癌组织PIN1阳性表达率明显高于对照组，且与淋巴结转移存在一定的关系，提示PIN1可能参与肿瘤产生、进展以及转移过程。国外研究者发现，PIN1表达与前列腺癌术后早期复发的危险性存在显著相关性，高表达者复发的危险性高于低表达者[10]。另有研究表明，过表达的PIN1可促进正常乳腺上皮细胞转化，且可稳固已被neu(c-erbB-2)和Ras癌基因诱导的恶性表型，敲除PIN1则可逆转此种恶性表型，甚至还会引发癌细胞凋亡[9]。故对PIN1表达进行测定对于肿瘤的诊断和治疗、预后具有一定的预测价值，并可作为潜在的治疗目标。

本研究结果显示，FPN在胃癌组织中低表达，且与胃癌的TNM分期存在相关性，与患者的性别、年龄、淋巴结转移均无显著相关性。大量研究亦报道了FPN在不同类型肿瘤中的表达及其临床意义[8-10]。国外研究结果显示，乳腺癌患者的FPN mRNA呈低表达，且与乳腺癌的预后有明显关系[8]。故笔者认为在胃癌组织中FPN是铁调素的下游目标之一，铁调素通过促进FPN低表达以及诱导FPN降解来对铁代谢进行调节，继而对肿瘤细胞的分裂增殖产生影响。此与相关国外研究结果一致。

综上所述，胃癌组织中存在FPN、PIN1蛋白阳性表达，且与患者的临床病理参数相关，今后笔者将在此基础上进行深入研究，使FPN、PIN1有可能作为判定胃癌TNM分期和高危转移的有效指标，并用于临床指导胃癌的治疗。