鱼鳞胶原蛋白提取残渣中角蛋白的回收与表征

李秋雨，刘红梅，李 彦，罗 灿，刘 焱,

(1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410128；2.湖南省发酵食品工程技术中心，湖南长沙 410128；3.芷江侗族自治县农业农村局，湖南芷江 419100；4.长沙理工大学化学与食品工程学院，湖南长沙 410128)

角蛋白是一类具有保护功能的非营养性纤维状硬蛋白，主要存在于动物的毛、发、角、爪及其他表皮结构中，其具有良好的生物活性、生物可降解性等，在医药、化妆品、生物材料等领域被广泛应用。因角蛋白的来源主要以动物的毛发和蹄壳为主，具有一定的争议性，使其原料来源在一定程度上受到了限制[1-5]。我国是水产品消费和生产的大国，每加工1000 t鱼，就将产生20～30 t鱼鳞副产物[6-8]。鱼鳞中的蛋白质占其干重的70%，且蛋白质主要为胶原蛋白和角蛋白[9]。目前，有关鱼鳞蛋白质方面的研究大部分都围绕着胶原蛋白，关于角蛋白的研究很少，且提取胶原蛋白后的鱼鳞残渣被丢弃，仍会造成资源的浪费。2018年我国草鱼产量达到550.43 t，湖南省草鱼产量为60.23 t，占国内养殖量的10.94%，排名第三，草鱼的加工量占其产量的18%～20%[10]。因此本研究从提取过胶原蛋白的鱼鳞残渣中提取角蛋白，不仅可以变废为宝，充分地回收利用鱼鳞，还能拓宽提取角蛋白的来源物，解决宗教信仰和产品安全性等方面的问题。

因此，本研究以提取过胶原蛋白的草鱼鱼鳞为原料，对提取草鱼鱼鳞角蛋白的最佳工艺进行探究，并对最佳工艺条件下提取的角蛋白进行表征，旨在从鱼鳞残渣中最大程度地回收角蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜草鱼鱼鳞 收集于长沙马王堆水产品市场；羊毛角蛋白标准品 Sigma Alderich公司；木瓜蛋白酶生化试剂 北京鼎国生物技术有限责任公司；丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250、Tris、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、柠檬酸、乙酸、溴酚蓝 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

FTIR-7600型傅里叶红外光谱仪 天津港东科技发展股份有限公司；UV2450型紫外分光光度计 岛津(香港)有限公司；DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂；日立L-8 900型全自动氨基酸分析仪 天美(中国)科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 新鲜草鱼鱼鳞→预处理→酸法或酶法提取胶原蛋白→残渣→蒸馏水清洗→碱法提取角蛋白

1.2.2 草鱼鱼鳞的预处理 称取20 g新鲜的草鱼鱼鳞，用蒸馏水清洗干净，在4 ℃条件下，依次用10%NaCl溶液、0.1 mol/L的NaOH溶液、1%的H2O2溶液分别处理12 h，然后用4%的柠檬酸溶液浸泡(料液比为1∶14)6 h。

1.2.3 胶原蛋白提取残渣的制备

1.2.3.1 胶原蛋白含量测定 以经预处理后的鱼鳞为原料，参照郭恒斌等[11]的方法，采用分光光度法对鱼鳞中羟脯氨酸的含量进行测定。胶原蛋白的含量由测得的羟脯氨酸的含量乘以相关系数(14.2)即得。

1.2.3.2 不同酸法分离草鱼鱼鳞胶原蛋白 称取20 g新鲜草鱼鱼鳞样品2份，经预处理后分别用400 mL度为0.5 mol/L的乙酸溶液和0.5 mol/L的柠檬酸溶液于4 ℃下浸泡提取24 h后过滤。将5 mol/L的氯化钠溶液添加到提取液，当样液浓度为0.9 mol/L时停止添加氯化钠溶液，然后静置盐析30 min，以4000 r/min的转速离心20 min，沉淀再分别用上述的两种酸溶液溶解后重复盐析，经多次盐析后的沉淀用对应的酸溶解后装入透析袋中，用蒸馏水透析3 d，每4 h换水一次，透析完成，冷冻干燥后制得胶原蛋白样品[12]。

1.2.3.3 不同酶法分离草鱼鱼鳞胶原蛋白 取20 g新鲜草鱼鱼鳞样品2份，经预处理后分别加入400 mL含0.60 g胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液和含0.60 g胃蛋白酶的1%(质量浓度)的柠檬酸溶液，于4 ℃下浸泡提取24 h后过滤。后续操作参照1.2.3.2。

1.2.4 单因素实验 分别考察NaOH浓度(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%)、料液比(1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5、1∶20、1∶22.5、1∶25、1∶27.5)、提取温度(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃)对角蛋白得率的影响。具体操作如下：提取胶原蛋白的鱼鳞残渣，按单因素条件处理后置于70 ℃下提取，直至鱼鳞残渣充分溶解后过滤。滤液pH用浓盐酸调至鱼鳞角蛋白等电点(pI=6.7)，室温下静置30 min，转速4000 r/min，沉淀用对应浓度的NaOH溶液溶解，溶解后装入透析袋中用超纯水透析，每4 h换水一次，透析3 d，冷冻干燥，称重，比较其得率大小[13-15]。

1.2.5 正交试验 在单因素实验的基础上，以角蛋白的得率为指标，探究氢氧化钠浓度、料液比、提取时间对角蛋白得率的影响。设计三因素三水平的正交试验，见表1。

表1 草鱼鱼鳞角蛋白提取工艺L9(34)正交试验因素水平表Table 1 Factors and level table for L9(34) orthogonal test of grass carp scales keratin extraction process

1.2.6 胶原蛋白去除率和角蛋白得率的计算

式中：m1：提取的胶原蛋白的质量，mg；m2：鱼鳞中胶原蛋白含量，mg；m3：提取胶原蛋白后鱼鳞残渣的质量，mg；m4：提取的角蛋白的质量，mg。

1.2.7 草鱼鱼鳞角蛋白的鉴定与分析

1.2.7.1 紫外光谱分析 准确称取10 mg纯化的鱼鳞角蛋白，用0.1 mol/L NaOH溶液将其溶解，然后定容至50 mL，制成0.2 mg/mL样液，于200～400 nm处进行光谱扫描，记录结果，与角蛋白标准品的紫外图谱进行对照，分析试验结果。

1.2.7.2 电泳分析 采用 SDS-PAGE 凝胶电泳对草鱼鱼鳞的角蛋白进行分析鉴定[16-18]。采用SDS-PAGE垂直平板电泳，凝胶厚度1.5 mm，分离胶8%，浓缩胶5%，样品上样量20 μL。

1.2.7.3 傅里叶红外光谱分析 将冷冻干燥后的鱼鳞角蛋白样品适量与少量溴化钾混合压片，然后进行红外光谱扫描，波数设定在400～4000 cm-1间，再分析图谱和试验结果。

1.2.7.4 氨基酸组成分析 采用氨基酸分析仪分析草鱼鱼鳞角蛋白中氨基酸的组成及含量。其检测条件为离子交换柱：26 mm×150 mm；分离柱柱温：53 ℃；进样体积：50 μL；洗脱液：IPH-1、2、3、4；泵流速：0.225 mL/min；分析时间：72 min。

1.3 数据处理

各组实验数据均重复3次，数据采用平均值±标准偏差的表示方式，用DPS2018进行统计学分析，用Origin 2018软件进行绘制试验结果图。

2 结果与分析

2.1 不同分离方法分离胶原蛋白的结果分析

2.1.1 不同分离方法分离胶原蛋白的效果分析 采用不同的方法分离草鱼鱼鳞胶原蛋白，对其去除率进行分析比较，探究不同分离方法对胶原蛋白去除效果的影响，结果如表2所示。

表2 不同分离方法的胶原蛋白去除率Table 2 Collagen removal rate of different separation methods

经测定，新鲜草鱼鱼鳞中胶原蛋白的含量为2.147 g/20 g。从表2可以看出，四种方法分离草鱼鱼鳞胶原蛋白的去除率存在显著性差异(P<0.05)，四种方法中，乙酸法分离草鱼鱼鳞胶原蛋白的去除率最低，为34.65%，柠檬酸法的去除率为40.80%，乙酸-胃蛋白酶法的去除率为70.24%，柠檬酸-胃蛋白酶法分离的胶原蛋白去除率最高，为87.94%。通过分析上述数据可知，单独的酸法分离胶原蛋白的去除率均较低，而在酸法的基础上添加胃蛋白酶来分离胶原蛋白其得率明显升高。因此可知，为更好地将鱼鳞中的胶原蛋白去除，四种方法中选择柠檬酸-胃蛋白酶法。

2.1.2 不同分离方法对胶原蛋白结构的影响 胶原蛋白二级结构变化的敏感区域是由于由C=O伸缩引起的酰胺Ⅰ带，其波数范围为1700～1600 cm-1。从图1可以看出，乙酸法和乙酸-胃蛋白酶法提取的鱼鳞胶原蛋白在1647 cm-1附近出现特征吸收峰，对应无规卷曲结构，这表明乙酸法和乙酸-胃蛋白酶法提取的胶原蛋白的酰胺Ⅰ带不具备三螺旋结构特征；柠檬酸法和柠檬酸-胃蛋白酶法提取的鱼鳞胶原蛋白在1655 cm-1附近出现特征吸收峰，对应α-螺旋结构，这表明柠檬酸法和柠檬酸-胃蛋白酶法提取的胶原蛋白的酰胺Ⅰ带具备三螺旋结构的特征。而四种方法提取的胶原蛋白在3325、3080、1545和1238 cm-1附近均出现特征吸收峰，其对应的三螺旋结构相同。综上可知，乙酸法和乙酸-胃蛋白酶法提取的胶原蛋白的三螺旋结构部分被破坏，结构保存不完整，而柠檬酸法和柠檬酸-胃蛋白酶法提取的胶原蛋白结构保存完整。结合前文中胶原蛋白去除率的大小可知，采用柠檬酸-胃蛋白酶法分离胶原蛋白的效果最好。因此，后续试验所用的原料为柠檬酸-胃蛋白酶法去除胶原蛋白后的残渣。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 不同NaOH浓度对角蛋白得率的影响 由图2可知，角蛋白的得率随着NaOH浓度的增加呈现先升高后降低的趋势。当NaOH的浓度小于8%时，鱼鳞角蛋白得率随着NaOH浓度的增大不断增大，当浓度达到8%时，角蛋白的得率最大，为4.56%。当NaOH浓度大于8%后，随着NaOH的浓度逐渐增加，角蛋白得率不断降低。因而NaOH浓度为8%时，角蛋白的得率最大。

2.2.2 不同料液比对角蛋白得率的影响 从图3可知，随着料液比增大，鱼鳞角蛋白得率先增加后降低，角蛋白得率最大，为4.16%，此时的料液比是1∶15。这可能是由于料液比的增大，相当于稀释了反应体系中的底物，增加物质反应面积，直至角蛋白的得率增加到最大值。此后随着溶剂浓度的增加，反应物稀释过大，阻碍了提取反应的进行，使角蛋白的得率降低。因此，当料液比为1∶15时，角蛋白的得率最大。

2.2.3 不同提取温度对角蛋白得率的影响 从图4可知，随着提取温度的升高，草鱼鱼鳞角蛋白得率先增加后缓慢降低，提取温度为60 ℃时，角蛋白得率达到最大值，为4.82%，此时，此后提取温度再升高，角蛋白得率缓慢降低。角蛋白得率降低的原因可能是当温度过高时，角蛋白的分子结构被破坏，导致其得率降低。由此可以确定，提取温度为60 ℃时，角蛋白的得率最大。

2.2.4 正交试验结果 以草鱼鱼鳞角蛋白的得率为试验指标，进行正交试验，结果如表3所示。由表3正交试验结果可知，影响角蛋白提取的三种因素中，因素的主次比结果为提取温度>氢氧化钠浓度>料液比。通过结果分析可知，试验的最佳的组合是A3B1C2，然后在相同条件下进行验证试验，平行3次，测得草鱼鱼鳞角蛋白的得率为6.031%，高于正交试验表中的最佳组合A3B3C2(角蛋白得率5.833%)，因此可以确定草鱼鱼鳞角蛋白的最佳提取工艺为A3B1C2，即在60 ℃的条件下，料液比为1∶12.5，以9%的NaOH溶液为提取液进行提取。

图1 不同方法分离的胶原蛋白的傅里叶红外光谱图Fig.1 Fourier transform infrared spectra of collagen isolated by different methods

图2 NaOH浓度对角蛋白得率的影响Fig.2 Effect of NaOH concentration on keratin yield

图3 料液比对角蛋白得率的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on keratin yield

图4 提取温度对角蛋白得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on keratin yield

表3 L9(34)正交试验结果Table 3 L9(34) orthogonal test results

2.3 草鱼鱼鳞角蛋白鉴定分析结果

2.3.1 紫外光谱分析结果 从图5中可知，草鱼鱼鳞角蛋白和羊毛角蛋白标准品的图谱在200～400 nm范围内均出现2个明显的吸收峰，鱼鳞角蛋白吸收峰的位置分别在218.2 nm及280.4 nm处，和羊毛角蛋白吸收峰的位置相近，但吸收峰的强度稍低于羊毛角蛋白。由此可以得出，草鱼鱼鳞角蛋白的峰谱符合羊毛角蛋白标准品的峰谱特征。

图5 紫外分析图谱Fig.5 Ultraviolet analysis spectrum

2.3.2 电泳分析的结果 从图6可以看出，在分子量48 kDa附近出现了一条清晰的电泳条带。其分子量大小与羊毛角蛋白分子量大小没有明显差异性，符合角蛋白的分子量特征[19-20]。

图6 草鱼鱼鳞角蛋白电泳分析结果Fig.6 Electrophoresis analysis result of grass carp scales keratin

2.3.3 红外光谱分析结果 通常以酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带这3处是否有特征吸收峰作为角蛋白二级结构完整性的评判依据[21-23]，从图7得出，角蛋白的特征吸收峰在1653.00、1525.69、1238.30、459.06 cm-1处，该特征峰出现的位置分别是由于伯酰胺的C=O伸缩振动、仲酰胺的C=O伸缩振动、羧基中的C-O伸缩振动、二硫键S=S伸缩振动吸收造成的，特征吸收峰出现的位置表示其二级结构保存完整[24-25]。角蛋白的二级结构中，α-螺旋是在1657～1651 cm-1处，β-折叠是在1694～1680 cm-1和1631～1621 cm-1处，无规卷曲是在1697～1670 cm-1处，鱼鳞角蛋白的特征吸收峰出现在1653 cm-1处，符合角蛋白结构中的α-螺旋结构的特征[26-27]。

图7 草鱼鱼鳞角蛋白红外分析图谱Fig.7 Fourier infrared spectrum analysis result of grass carp scales keratin

2.3.4 氨基酸组成鉴定结果 从表4可知，两种角蛋白中均检测出18种氨基酸，其中有7种必需氨基酸，且两种角蛋白中均未检测出羟脯氨酸。鱼鳞角蛋白中的胱氨酸占总氨基酸含量的14.9%，与角蛋白中含有丰富的胱氨酸，其占总氨基酸的14%～15%的研究结果相符[28-29]。研究表明，胶原蛋白的特征氨基酸为羟脯氨酸，且不含色氨酸，而含有大量的甘氨酸，占总氨基酸的三分之一[30-32]。而从表4中可以发现，鱼鳞角蛋白样品中虽检出甘氨酸，但其含量仅占总氨基酸的7.69%，且胶原蛋白的特征氨基酸未见检出。与羊毛角蛋白相比，除组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、精氨酸含量差异大于2 g/100 g外，其他氨基酸含量无较大的差异(含量差小于2 g/100 g)。综上可知，草鱼鱼鳞角蛋白的氨基酸组成和含量基本符合羊毛角蛋白的氨基酸组成和含量的特征。

表4 氨基酸的组成及含量(g/100 g)Table 4 Amino acid analysis results of grass carp scale keratin (g/100 g)

3 结论

本研究结果表明，柠檬酸-胃蛋白酶法去除胶原蛋白的去除率最高，为87.94%，去除的胶原蛋白结构保存完整。提取角蛋白的最优工艺条件：NaOH浓度9%、料液比1∶12.5、提取温度60 ℃。在该最优工艺条件下，对提取的目的蛋白进行鉴定和分析，结果发现：鱼鳞角蛋白吸收峰出现的位置在218.2、280.4 nm处，与羊毛角蛋白的出峰位置相似；凝胶电泳分析显示，鱼鳞角蛋白的相对分子质量在48 kDa左右，符合角蛋白的分子量特征；傅里叶红外光谱分析显示目的蛋白的二级结构属于α-螺旋结构，此蛋白质属于α-角蛋白。氨基酸组成分析表明所提取的蛋白质的氨基酸组成与角蛋白的特征基本相符。综上可知，从提取过胶原蛋白的鱼鳞残渣中提取的蛋白质为α-角蛋白。本研究在保证胶原蛋白提取率最大及结构保存完整的条件下，对鱼鳞残渣中的角蛋白进行提取，对充分回收利用角蛋白具有重大的意义。