上皮性卵巢癌患者血清miR-222-3p、HE4及CA125的表达及其临床意义*

苏红娥 钟庆吉 符春丽 薛万兴 林元

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿，病情进展迅速。中国的癌症统计数据显示，2015年中国卵巢恶性肿瘤发病率为52.1/10万，死亡率为22.5/10万，可见卵巢恶性肿瘤对女性的生命健康造成极大的危害[1]。因此，寻找一种能早期筛查EOC的肿瘤标志物对EOC患者尽早治疗和改善预后具有重要意义。目前研究发现，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）参与细胞增殖、分化、凋亡和新陈代谢等生物学过程，在EOC的发生发展中起到重要的作用，有望成为新的肿瘤生物标志物[2，3]。近期的研究表明，miR-222-3p在EOC中异常表达，其通过调控多种信号通路参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，可能在EOC的发生发展中扮演重要角色[4]。人附睾蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）是一种新型肿瘤标志物，在良性肿瘤及正常组织中含量极低，但在EOC中含量较高，对于早期鉴别和诊断EOC具有重要的价值[5]。糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）是目前诊断EOC的常用肿瘤标志物，其在EOC中高度表达，对EOC的诊断、化疗监测及预后评估具有一定作用[6]。本研究通过检测EOC患者血清miR-222-3p、HE4及CA125水平，分析其与EOC患者临床病理特征的联系，判断其诊断EOC的价值，旨在为EOC的诊治及靶向治疗提供参考依据。

资料与方法

1 研究对象 选取2017年1月1日～2019年12月31日本院收治的EOC患者118例，年龄35～77岁，平均（55.84±10.36）岁。纳入标准：①符合国际妇产科联合会（FIGO）分类标准和WHO分级标准[7]增加引用，且经病理确诊为EOC；②初治EOC，能配合本次研究及病历资料完整者。排除标准：①术前已行放疗、化疗或激素治疗者；②合并其他恶性肿瘤及自身免疫疾病，无法配合本次研究者。另选取同期与EOC患者年龄匹配的上皮性卵巢良性肿瘤患者105例作为良性组和正常健康女性60例作为对照组。本研究经我院伦理委员会批准（批准号：2017-215），并与患者或家属签署知情同意书。

2 标本采集和处理 所有研究对象均于治疗前，住院次日采集空腹静脉血5 mL，置于未加抗凝剂的离心管中，采用LG-25M立式离心机3 500 r/min、离心半径12.5 cm，离心10 min。收集血清放入-80℃低温冰箱保存待测，剔除溶血标本。

3 miR-222-3p检测 miR-222-3p引物：上游5'-AGCTAGGATCTAGTGACGAG-3'，下游5'-GCATGACGCATGCAGTCTAG-3'。在ABI 7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上进行实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）。反应体系为20 μL：1 μL引物及探针Mix（20×），10 μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μL反向转录脱氧核糖核酸，7.67 μL双蒸馏水。扩增条件：95℃预变性10 min、95℃变性15 s、60℃复性60 s进行45个循环，实验重复3次。以U6为内参照，采用2-△△Ct法计算miR-222-3p的相对表达水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

4 HE4及CA125检测 采用罗氏E601电化学发光免疫分析仪及配套试剂，化学发光法测定血清HE4及CA125水平，HE4＞150 pmol/L为阳性，CA125＞35 U/mL为阳性，操作过程严格按照试剂说明书及仪器操作规程进行。

结 果

1 各组临床一般资料比较 EOC组、良性组和对照组三组间一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组临床一般资料比较

2 各组血清miR-222-3p、HE4及CA125水平比较 EOC组血清miR-222-3p、HE4及CA125水平均明显高于良性组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.001）；而对良性组与对照组血清miR-222-3p、HE4及CA125水平进行比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组血清miR-222-3p、HE4及CA125水平比较±

表2 各组血清miR-222-3p、HE4及CA125水平比较±

注：与对照组比较，aP＜0.001；与良性组比较，bP＜0.001

组别 对照组 60 0.73±0.24 48.60±9.75 20.72±9.40良性组 105 0.84±0.35 53.46±11.63 26.83±11.56 EOC组 118 1.62±0.74ab 346.20±58.72ab 307.60±94.25ab F值 13.218 16.574 11.370 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 EOC患者血清miR-222-3p、HE4及CA125表达与临床病理特征的关系 随着EOC临床分期增高，血清miR-222-3p、HE4及CA125水平逐渐升高，Ⅲ～Ⅳ期EOC患者血清miR-222-3p、HE4及CA125水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期，差异均有统计学意义（P＜0.01）；低分化EOC患者血清miR-222-3p、HE4及CA125水平明显高于中高分化，差异均有统计学意义（P＜0.01）；有淋巴结转移EOC患者血清miR-222-3p、HE4及CA125水平明显高于无淋巴结转移，差异均有统计学意义（P＜0.01）。而对浆液性囊腺癌、子宫内膜样癌、混合型上皮癌三组间miR-222-3p、HE4和CA125的表达水平进行比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 EOC患者血清miR-222-3p、HE4及CA125表达与临床病理特征的关系

4 血清miR-222-3p、HE4及CA125水平对EOC的诊断价值 血清miR-222-3p、HE4及CA125水平诊断EOC的最佳截断值分别为1.16、187.50 pmol/L、162.80 U/mL，三项联合诊断EOC的曲线下面积（0.948，95%CI：0.887～0.995）明显高于单项miR-222-3p（0.842，95%CI：0.784～0.903）、HE4（0.866，95%CI：0.804～0.926）及CA125（0.797，95%CI：0.742～0.856），差异有统计学意义（Z=5.816、4.974、6.735，P＜0.05），其敏感度和特异度为96.8%和89.5%。见表4和图1。

表4 血清miR-222-3p、HE4及CA125水平对EOC的诊断价值

图1 血清miR-222-3p、HE4及CA125水平诊断EOC的ROC曲线

5 EOC患者血清miR-222-3p表达水平与HE4及CA125的相关性 Pearson相关分析显示，EOC患者血清miR-222-3p表达水平与HE4（r=0.847，P＜0.001）和CA125（r=0.793，P＜0.001）分别呈正相关。见图2。

图2 血清miR-222-3p表达水平与HE4及CA125的相关性

讨 论

EOC是常见的妇科恶性肿瘤之一，也是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤，其发生发展是一个多阶段、多因素共同作用的结果，涉及原癌基因和抑癌基因的遗传学和表观遗传学改变。miRNA作为一类非编码小RNA，广泛存在于真核生物中，通过在转录后水平调控靶基因的表达，参与调控细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移和分化等过程，在EOC的发生发展中发挥着重要的作用，有望成为EOC诊断和治疗的重要靶点[8，9]。LIU等[10]研究发现，miRNA在EOC细胞中过表达，其通过促进Erk1/2和ART的磷酸化，从而激活MAPK和PI3K/AKT信号通路，进而促进EOC细胞的增殖和侵袭转移。ZHANG等[11]研究认为，miRNA在卵巢癌组织和细胞中均呈高表达，其通过抑制SOCS1和p21的表达，增加Cyclin D1的表达，增强SKOV3和OVCAR3细胞株的生长能力，增加细胞克隆代数，从而促进卵巢癌的发生发展。另有研究表明，卵巢癌组织和细胞中miRNA呈高表达，其通过抑制SFRP1、AXIN2和ICAT的表达，启动WNT/β-catenin信号通路，从而促使卵巢癌细胞向肿瘤干细胞转化，为卵巢癌的筛查及靶向治疗提供新的方向[12]。

本研究显示，EOC组血清miR-222-3p、HE4及CA125水平均明显高于良性组和对照组，提示血清miR-222-3p、HE4及CA125水平在EOC患者中异常高表达，其可能通过发挥癌基因的作用来参与EOC的发生发展。杨堃等[13]研究也显示，EOC患者血清HE4及CA125水平高于良性组和对照组，而良性组和对照组之间无显著差异，提示HE4及CA125水平变化与EOC发生发展有关。另有研究认为，miR-222-3p在EOC中表达异常，在EOC的发病机制中发挥关键作用，可能成为EOC潜在的治疗靶点[14]。本研究中，在高临床分期、低分化程度及有淋巴结转移的EOC患者，miR-222-3p、HE4及CA125水平均明显升高，提示miR-222-3p、HE4及CA125水平升高可能促进EOC的病情进展，其高表达可导致一系列靶向的癌基因过度激活，从而参与EOC的发生发展。唐梅等[15]研究发现，血清HE4及CA125水平升高与EOC患者的分化程度、临床分期及淋巴结转移密切相关，是影响EOC患者预后的独立因素。另有研究认为，miRNA表达水平与EOC的临床分期、淋巴结转移及预后密切相关，可能是EOC诊断及预后判断的新型生物学指标[16]。

本研究应用ROC曲线进行分析，结果显示血清miR-222-3p、HE4及CA125水平诊断EOC的最佳截断值分别为1.16、187.50 pmol/L、162.80 U/mL，单项检测对EOC诊断的敏感度和特异度均不高，其临床应用具有一定的局限性，三项联合诊断EOC的曲线下面积高达0.948（95%CI：0.887～0.995），其敏感度和特异度为96.8%和89.5%。相关分析显示，EOC患者血清miR-222-3p表达水平与HE4及CA125均呈正相关（P＜0.001），可见三者之间具有良好的相关性，三项联合检测有助于提高EOC诊断的价值。王丹等[17]研究显示，血清肿瘤标志物HE4及CA125水平在EOC患者中明显升高，其联合检测优于HE4、CA125单项检测，能为EOC的诊断及病情评估提供更好的价值。MONTAGNANA等[18]研究表明，血清miRNA表达水平上调与EOC发生、发展有关，可作为诊断EOC的潜在生物标志物，在未来有较好的应用前景。

综上所述，miR-222-3p水平在EOC患者中明显升高，且与EOC的发生发展密切相关，联合传统肿瘤标志物HE4及CA125检测有助于提高EOC诊断的敏感度和特异度，同时也为了解EOC的发病机制及靶向治疗提供新的思路。但这些研究仍处于初步探索阶段，未来仍需更多大规模多中心的临床研究来进一步证实血清miR-222-3p在EOC中的临床应用价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突