鸡源弯曲菌的分离鉴定和耐药性检测

廖昕萌，陈凯风，周华亮，林琦杰，张建民*

(1.南方医科大学检验与生物技术学院，广东广州 510515；2.华南农业大学兽医学院农业农村部兽用疫苗创制重点实验室/农业农村部人兽共患病重点实验室/广东省动物源性人兽共患病重点实验室/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室，广东广州 510642；3.深圳海关动植物检验检测技术中心，广东深圳 518026)

弯曲菌(Campylobacter)是一种重要的人畜共患病原菌，常见的有空肠弯曲菌(C.jejuni)和结肠弯曲菌(C.coli)[1-2]。人可通过食用未煮熟的肉类感染弯曲菌[3]，严重时会引起吉兰-巴雷综合征(Guillain-barrst.Ref.96a，GBS)[4]。据监测网估算，弯曲菌每年可致全球1.66亿人感染[5]。近几年弯曲菌污染情况日益严重，在欧洲一些地区弯曲菌已成为首要的致病菌，其发病率已经超过了沙门氏菌、志贺氏菌及李斯特氏菌。而在中国食源性致病菌中弯曲菌占比10.8%，仅次于大肠埃希氏菌，成为第二大致病菌[5]。已有研究表明，鸡肉是弯曲菌的主要传染源[6]，弯曲菌可在鸡肠道内大量定殖。因此，在规模化养殖场中很容易发生弯曲菌的流行和传播。

目前，对于弯曲菌的治疗主要采用抗生素，但由于抗生素在畜禽养殖中的不规范使用，弯曲菌的耐药性显著升高[7-8]，已有研究表明耐药弯曲菌多来自于禽类，且对环丙沙星和四环素耐药性呈上升趋势[9]，其中结肠弯曲菌对大环内酯类抗生素耐药率普遍较高[10]。由此可见，对肉鸡弯曲菌的耐药性研究显得尤为重要。

广东省是肉鸡养殖和消费大省，但肉鸡养殖中弯曲菌的研究数据相对较少。因此，本研究以广东省某肉鸡养殖场为研究对象，跟踪监测该场弯曲菌的流行和耐药情况，为肉鸡养殖中弯曲菌病的预防和治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 药敏试验质控菌株(弯曲菌标准菌株 NCTC11168)为华南农业大学兽医学院动物传染病教研室保存。

1.1.2 培养基和试剂 哥伦比亚血琼脂基础培养基(Columbia Blood Agar Base)、改良 CCD 琼脂培养基、改良 Skirrow 氏琼脂、去纤维绵羊血PBS溶液，广东环凯微生物科技有限公司产品；丙三醇(甘油)、Goldview核酸染料，天根生化科技有限公司产品；rTaqDNA聚合酶(PremixTaq)、DNA Marker DL 2 000，TaKaRa公司产品；琼脂糖，Biowest公司产品；无菌脱纤维绵羊血，广州蕊特生物技术公司产品。

1.1.3 药敏试纸 药敏纸片，英国OXOID公司产品；ESBLs药敏纸片，杭州滨和微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 纯水仪(Elix100)，美国Millipore公司产品；离心机(5430 R)，Eppendorf公司产品；高压蒸汽灭菌锅(MLS-3780)，日本Sanyo公司产品；超净工作台(YJ-1450)，苏州净化设备厂产品；凝胶成像系统(Gel Doc XR)、PCR仪(T100 Thermal Cycler)、电泳仪(Power PacTM)，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 弯曲菌的分离与鉴定 样品的采集和分离纯化主要参考国家标准GB4789.9-2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》。于2018年12月至2019年6月从广东省广州市某肉鸡养殖场中随机采集泄殖腔拭子样品140份。所有样品在2 h内与干冰一起转移到实验室，之后将棉签拭子直接划线到哥伦比亚血琼脂平板上(含50 mL/L无菌脱纤维绵羊血)，然后在微需氧条件(85% N2，10% CO2，5% O2)下42℃培养48 h，挑取具有弯曲菌特征的菌落，同时三区划线接种在Skirrow血琼脂平板和CCD琼脂平板上，继续培养36 h～48 h，再次挑取具有明显弯曲菌特征的疑似菌落采用煮沸法提取DNA模板，通过弯曲菌属16S rRNA、空肠弯曲菌MapA基因和结肠菌ceuE基因的多重PCR进一步鉴定。引物序列相关信息见表1。

表1 弯曲菌PCR鉴定引物

PCR反应体系为25 μL：16S rRNA 上、下游引物各0.3 μL，mapA、ceuE上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，rTaq聚合酶12.5 μL，ddH2O补齐至25 μL。

PCR反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 90 s，72℃ 60 s，共35个循环；72℃ 10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并拍照。

1.2.2 药敏试验 选择9类12种抗菌药物，根据世界卫生组织推荐的KB纸片扩散法和美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的Kirby-Bauer法进行抗生素药物敏感性试验，弯曲菌标准菌 NCTC11168为质控菌，结果参照CLSI制定的药敏试验抑菌环执行标准判断。12种药敏纸片名称规格及判断标准见表2。

表2 KB法药敏试验判定标准

1.2.3 耐药基因检测 对分离到的弯曲菌用PCR扩增的方法检测三大类常用于弯曲菌治疗药物的耐药基因，分别为大环内酯类：ermB；氨基糖苷类：aacA4、aac(6′)-Ie、aph(2″)-If、aph2-Ig；四环素类：tet(O)。参照文献[11-12]设计三类耐药基因鉴定引物，具体的序列信息见表3。

表3 耐药基因引物信息

PCR反应体系为25 μL：上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，rTaq聚合酶12.5 μL，ddH2O补齐至25 μL。

PCR反应程序为：预变性95℃ 5 min；变性95℃ 30 s，退火温度按照表3中的退火温度设置30 s，延伸72℃ 60 s，共35个循环；最后延伸72℃ 10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并拍照。

2 结果

2.1 弯曲菌分离鉴定结果

阳性弯曲菌分离株在改良Skirrow琼脂平板上形成灰色、扁平、有光泽的菌落。通过多重PCR检测，电泳可见空肠弯曲菌扩增出2条大小为857 bp和589 bp的目的片段，结肠弯曲菌扩增出2条大小为857 bp和462 bp的目的片段(图1)。

M.DNA标准DL 2 000；N.阴性对照；1～16.空肠弯曲菌(857 bp和589 bp)；17～22.结肠弯曲菌(857 bp和462 bp)M.DNA Marker DL 2 000；N.Negative control；1-16.C.jejuni (857 bp and 589 bp)；17-22.C.coli (857 bp and 462 bp)

从广东省某肉鸡养殖场共采集泄殖腔拭子样品140份，共分离到75株弯曲菌，分离率为53.6%，其中结肠弯曲菌的分离率为30.0%(42/140)，空肠弯曲菌的分离率为23.6%(33/140)，结肠弯曲菌的分离率高于空肠弯曲菌的分离率。

2.2 弯曲菌分离株的耐药情况

KB纸片法检测结果表明，75株分离菌对12种抗菌药物耐药率最高的是萘啶酸(88.0%)，其次是四环素(81.3%)、磺胺复合物(80.0%)、链霉素(80.0%)、克林霉素(77.3%)、红霉素(73.3%)、环丙沙星(73.3%)、氨苄西林(72.0%)、庆大霉素(68.0%)、氟苯尼考(29.3%)，对阿米卡星(17.3%)和替加环素(2.7%)的耐药率相对较低。有2株结肠弯曲菌对替加环素产生耐药，耐药率为2.7%。总体上看，结肠弯曲菌分离株耐药率高于空肠弯曲菌分离株。75株弯曲菌中有69株弯曲菌对3类及以上的药物耐药，为多重耐药菌株，多重耐药率达到了92.0%(69/75)，结肠弯曲菌和空肠弯曲菌的多重耐药率分别达到了52.0%和40.0%。多重耐药中主要以耐7种和6种抗菌药物的菌株为主，占比分别为15.0%和15.4%，其次为耐8种抗菌药物(9.8%)、耐5种抗菌药物(9.8%)和耐4种抗菌药物(8.4%)。有1株结肠弯曲菌对12种抗菌药物全部产生耐药。

75株弯曲菌共产生了47个耐药谱，其中结肠弯曲菌产生了31个耐药谱，空肠弯曲菌产生了22个耐药谱。结肠弯曲菌耐药谱中优势耐药谱为GEN+STR+ERY+CIP+NAL+TET+CLI+FFC+AMP+SXT(25.8%)，空肠弯曲菌耐药谱中优势耐药谱为GEN+STR+ERY+CIP+NAL+TET+CLI+AMP+SXT(31.8%)。

2.3 耐药基因的检测

对四环素、大环内酯类和氨基糖苷类三大类常用抗生素进行耐药基因携带率的检测结果显示，检出率最高的是四环素类耐药基因tet(O)，为62.7%；其次为大环内酯类耐药基因ermB和氨基糖苷类耐药基因aph(2″)-If，分别为54.7%和48.0%，而氨基糖苷类耐药基因aac(6′)、aacA4、aph2-Ig的检出率较低，依次为10.7%、4.0%、12.0%。总体上，结肠弯曲菌的耐药基因携带率要比空肠弯曲菌的高，且aac(6′)和aacA4在空肠弯曲菌中并未检出。

3 讨论

弯曲菌是一种重要的食源性致病菌，其中家禽被认为是人类感染弯曲菌的主要来源[13]。随着养殖业、食品贸易的国际化，多数发达国家都有一套对弯曲菌的系统化监控计划。发展中国家也越来越重视食品动物源性弯曲菌的流行情况监测[14]。在对广东省某肉鸡养殖场中弯曲菌的分离鉴定和耐药性研究检测中发现，弯曲菌的分离率(53.6%)比张小燕等[15]报道的江苏地区鸡源弯曲菌分离率(38.68%)和张秀丽等[16]报道的河南省肉鸡养殖场弯曲菌的分离率(31.1%)均要高。尽管我们的研究是在冬春季节采样，温度相对较低，但弯曲菌分离率依旧很高，可以看出广东省弯曲菌的污染情况较为严重，这可能是由于华南地区常年高温湿润的天气更有利于弯曲菌的生长繁衍。

在分离株中结肠弯曲菌的分离率(30.0%)比空肠弯曲菌的分离率(23.6%)高，与之前国内外其他地区报道的空肠弯曲菌分离率较高的流行规律不同[17-19]。原因可能是不同地区气候情况、季节性变化、地理位置、常规消毒和整体消毒的不同造成了弯曲菌流行分布的差异。

在本研究中弯曲菌分离株对氟喹诺酮类药物显示出了较高的耐药率，特别是对萘啶酸耐药率达到了88.0%，可能是因为氟喹诺酮类药物是经验性治疗未确诊腹泻的首选药物，应用较为广泛所致。四环素可作为氟喹诺酮类药物的替代药用于弯曲菌的治疗，但在本研究中四环素类抗生素的耐药率高达81.3%。大环内酯类抗生素(如红霉素)是治疗经培养确认的弯曲杆菌病例的一线药物，当发生严重的全身感染时应使用氨基糖苷类药物(如庆大霉素)进行治疗，本研究显示红霉素(73.3%)和庆大霉素(68.0%)的高耐药率，与之前国内的报道一致[20]，但是远高于先前国外的相关耐药报道。这表明我国弯曲菌的耐药性已经比较严重。值得注意的是，替加环素被称为治疗细菌性感染的最后一道防线，在本研究中有2株结肠弯曲菌对其产生了耐药，耐药率为2.7%。

本研究肉鸡养殖场弯曲菌的多重耐药率高达92.0%，提示广东省弯曲菌的耐药情况严峻，应该做好相关的检测和监控。在耐药率和多重耐药率方面，结肠弯曲菌均要高于空肠弯曲菌，这也可能是本研究养殖场中结肠弯曲菌分离率高于空肠弯曲菌的原因。

由于分离弯曲菌对常用于弯曲菌治疗的四环素类、大环内酯类和氨基糖苷类三类抗生素产生了较高的耐药率，所以在耐药基因方面做了进一步的研究。发现四环素耐药基因tet(O)的携带率最高为62.7%，这个结果与之前报道的tet(O)为最高携带率耐药基因的结果一致[21]，但是，在本研究中四环素的耐药率并不是最高，这表明在导致四环素的耐药方面还可能存在其他的机制。在大环内酯类耐药基因携带方面发现ermB基因呈现阳性，该基因不仅可以介导大环内酯类高水平耐药，而且在自然条件下可在不同的菌株之间进行水平传播，因此，该基因的携带可能会引起养殖场对大环内酯类药物耐药率的进一步升高。氨基糖苷类耐药基因中以aph(2″)-If的检出(48.0%)为主，这与之前报道的aph(2″)-If的检出率远高于其他基糖苷类耐药基因的结果相同[22]。这表明aph(2″)-If可能是造成氨基糖苷类药物耐药的主要原因。

综上所述，该鸡场弯曲菌分离率较高，弯曲菌污染较为严重，提示在肉鸡养殖场中应加强弯曲菌的检测和防控。分离株中结肠弯曲菌为优势菌株，且分离的弯曲菌耐药和多重耐药情况严重，因此在防控方面应该根据实际流行状况规范用药。研究结果补充了广东地区肉鸡养殖场弯曲菌流行病学数据，可为弯曲菌病的防控和治疗提供科学依据。