生长分化因子8在哺乳动物中的功能研究进展

王蕊彬，任雪华，雷安民

(西北农林科技大学动物医学院，陕西省干细胞工程技术中心，陕西杨陵，712100)

生长分化因子8 (growth differentiation factor 8,GDF8)又称肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)，是转化生长因子-β(transformation Growth Factor-β,TGF-β)超家族成员之一。GDF8最初是在“mighty mouse”模型产生后开始受到关注的，这是一个靶向GDF8基因的淘汰敲除模型[1]。此后，大多数研究集中于GDF8在肌肉未分化和调控骨骼肌生长发育方面的功能。自从在人体卵泡液(follicular fluid,FF)和子宫中首次检测到GDF8以来[2]，GDF8在生殖系统中的功能作用引起了人们的关注。同时GDF8作为家畜育种的靶向基因，其在生殖系统的作用也日趋受到关注[3]。卵泡在其连续的发育过程中需要卵母细胞和颗粒细胞、颗粒细胞和膜细胞之间的双向交流，在这些交流中涉及许多TGF-β超家族的细胞外信号分子[4]。

因此，TGF-β通路被认为是卵母细胞成熟的关键调控通路之一，众所周知的卵母细胞分泌因子(oocyte secretory factors,OSFs)，如生长分化因子9 (growth differentiation factor 9,GDF9)和骨形成蛋白15 (bone morphogenetic protein 15,BMP15)是卵丘细胞(cumulus cells,CCs)中调控关键信号通路的蛋白，许多研究已经阐明了卵母细胞- CCs调控环在卵子发生过程中的生理机制。但是GDF8作为壁颗粒细胞分泌因子之一，其在卵母细胞成熟和卵泡发育过程中的生理功能尚不清楚是，因此需要对GDF8的功能作用进行评估。此外，TGF-β超家族分子广泛存在于从线虫到哺乳类动物之中，通过调节细胞增殖、分化、黏附、移行及凋亡，诱导软骨形成、分化，在生物整体及各种器官的发育、损伤后修复中起着重要作用，同时也参与多种病理过程[5]。GDF8作为 TGF-β 超家族的重要一员，在胚胎发育中也发挥着举足轻重的作用，最近的研究还发现 GDF8可作为改善乳腺癌全身治疗的靶点，并且对其他器官无细胞毒性[6]，这些研究都表明了GDF8有很大的潜在应用价值和研究意义。本文将从GDF8基因的结构特征，在卵母细胞中的作用机制，信号通路以及在不同哺乳动物中的研究进展等几方面进行阐述。

1 GDF8基因的发现及其结构特征

GDF8最初是在肌肉骨骼系统中发现的，是TGF-β超家族的成员之一[7]。TGF-β超家族可分为3个亚类，即TGF-βs、骨形成蛋白(BMPs)和激活素(activins)/抑制素(inhibin)。生长分化因子8和11(分别为GDF8/myostatin和GDF11/BMP11)是激活素/抑制素亚类的两个密切相关成员，在其成熟的C端信号域和N端前域分别具有90%和52%的序列同源性[8]。

所有TGF-β超家族成员都是由1个信号肽、1个引导其二聚的前体和1个成熟结构域组成的大的前体蛋白合成的[9]。与TGF-β家族其他成员相似,MSTN先合成52 ku的前体蛋白质,由信号肽、编码前肽(26 ku)的N-末端区和编码成熟肽(12.5 ku)的C-末端区3部分组成,在N-末端区和C-末端区之间有一个保守的蛋白酶水解位点RSRR(Arg-Ser-Arg-Arg)[10]。MSTN的前体蛋白质需经二次蛋白酶水解活化,去除信号肽,去除信号肽后，二聚体前蛋白被类糠蛋白酶切割，二聚体成熟蛋白分泌。其特点是第4个半胱氨酸残基被丝氨酸取代，第4个半胱氨酸是参与亚单位间二硫键形成的唯一半胱氨酸，存在于除GDF9和BMP15外的所有TGF-β超家族成员中[11]

切割前体蛋白质产生N-端前肽和C-端多肽,C-端多肽通过二硫键相连形成具有生物学活性的二聚体发挥其功能,构成MSTN成熟蛋白分泌至血液循环,并与N-端前肽以非共价键形式形成 LAP(lantency-associated peptide)。随后的研究表明,MSTN前肽不仅在C-末端折叠成正确的半胱氨酸结构中起着重要的作用,而且GDF-8前肽可以作为GDF-8生物活性的抑制剂[12]。在LAP,前肽维持C-末端二聚体成为无活性的、惰性的状态。除了前肽,体外试验表明,follistatin、FLRG、GASP-1也能够与C-末端二聚体结合,抑制它的活性[13]。

此外，在GDF8蛋白的N-末端有非亲水性氨基酸序列，作为分泌信号，在C-末端有保守的蛋白酶水解位点RSRR，一般有9个半胱氨酸位于C-末端形成“半胱氨酸节点”，其C-末端以二硫键形成具有生物学活性的二聚体发挥其功能[14]。MSTN基因在进化过程中非常保守,决定蛋白生物活性的 C末端区域在小鼠 、大鼠 、人 、猪 、鸡 、火鸡之间完全相同,表明这个基因的功能在脊椎动物中也高度保守[10]。小鼠MSTN基因cDNA序列中只有1个开放阅读框架(opening reading frame,ORF),编码376个氨基酸。GDF-8前肽C-末端区域对其功能的稳定性具有重要的作用,抑制性区域位于第42-115位氨基酸之间[1]。

2 GDF8在卵母细胞中作用机制

卵母细胞体外成熟(IVM)成功的一个重要指标是卵母细胞的核成熟,这是通过减数分裂完成到中期(MII)来评估的,具有明显挤压极体的卵母细胞被认为是成熟的MII卵母细胞。在Song K和他的同事的研究中[15]，他们将MSTNP(MSTN抑制剂)组与对照组和空白组相比，发现在减数分裂的MII期卵母细胞数量明显减少，说明MSTN可能在IVM期促进细胞核成熟中发挥重要作用[16]。

此外，卵巢产生的类固醇激素对于维持正常的卵巢功能有重要意义。众所周知，卵泡由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞组成。从排卵前的前腔卵泡(0.1 mm～0.2 mm)向有腔卵泡(0.2 mm～0.4 mm)的转变过程需要颗粒细胞和膜细胞的快速生长以及卵泡腔的增大。在形成有腔卵泡之后，卵泡才会对促性腺激素产生反应。而颗粒和膜细胞是促性腺激素的活动场所，也是产生类固醇激素的场所。卵泡膜细胞对黄体生成激素(luteinizing hormone,LH)作出反应，并在排卵前的有腔卵泡中产生雄激素和孕激素。颗粒细胞对卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)产生反应并产生雌激素。排卵前有腔卵泡内的颗粒细胞也会对黄体生成素作出反应并产生黄体酮，从而促进颗粒细胞的生长和分化以及卵母细胞的成熟来促进优势卵泡的发育。

早在Li Q等人的研究中就发现，TGF-β超家族成员的信号转导是卵巢类固醇形成的必要条件，主要通过SMAD2/3通路参与调节卵母细胞产生的信号，这些信号对于协调排卵过程有重要意义[17]。为了探究GDF8和性激素的关系，Chang HM等人[18]用GDF8处理了体外培养的人颗粒黄体素细胞(human granulosa-lutein cells，hGL)，发现GDF8处理后细胞色素P450芳香化酶(aromatase)、FSH受体和雌二醇的水平均升高，而类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)受体和孕酮的水平却在GDF8处理后降低。

此外，促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)能够刺激芳香酶/雌二醇的产生，LH诱导StAR/孕酮的产生。此外，Chang HM等人还发现，GDF8预处理24 h可增强FSH对芳香酶/雌二醇诱导的作用，同时GDF8可抑制LH对StAR/孕酮刺激的作用。Chang HM等人的研究结论也在Lin TT和他的同事研究中得到证实,Chang HM等人发现，GDF8的表达与窦性卵泡的生长呈正相关，同时GDF8可以促进雌二醇的产生，并增强颗粒细胞(GCs)对FSH的反应性[19]。

3 GDF8在卵母细胞中的信号通路

由转化生长因子β(TGF-β)超家族传递的信号在胚胎发育、组织稳态和再生、免疫反应、肿瘤抑制和转移等方面有广泛的作用，这些因素也控制着许多干细胞群的行为。TGF-β分泌因子，根据细胞类型、环境、配体表达和剂量，它们可以发挥多效性，有时是相反的细胞效应，包括增殖、分化、迁移和死亡。除了3个TGF-βs (TGF-β 1-3)外，该超家族还包括骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)、生长分化因子(GDFs)、抗苗勒氏管激素(AMH)、激活素和Nodal。在后生动物的进化过程中，许多TGF-β家族成员及其下游通路成分都是保守的[20]。

在卵巢中，卵母细胞和GCs之间的双向通信包括营养物质和信号的交换，信号之间通过自分泌和旁分泌的复杂调控网络影响体细胞和卵母细胞的生长和分化。卵母细胞也能通过诱导CCs产生积极的调节因子来影响其自身的发育能力，而这些调节因子又反作用于卵母细胞。例如，去核卵母细胞或外源性重组GDF9或BMP15产生的因子能够增加卵丘-卵母细胞复合物体外成熟(IVM)和体外受精(IVF)后囊胚形成率[11]。

TGF-β超家族成员传递信号主要通过膜表面的Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸受体。后者通过磷酸化Sma-和Mad相关蛋白(SMAD)转录因子进一步调节下游基因表达。到目前为止，五个不同类型Ⅱ受体(BMPR2,ACVR2A,ACVR2B,TβR2和AMHR2)和7个Ⅰ型受体(也称为激活素受体ALKs1-7)已在哺乳动物中发现[21]。所有这些受体都具有一个非常相似的结构，包括一个胞外结构域(N端)、一个跨膜结构域和一个具有Ser/Thr激酶活性的胞内结构域(C端)。TGF-β超家族成员的每个配体都能与Ⅱ型和Ⅰ型受体不同组合的胞外结构域(N端)结合并触发下游信号复合物。

在GDF8信号传导过程中，GDF8先被Ⅱ型受体ActRIIA/B识别，然后与丝氨酸/苏氨酸激酶受体(Ⅰ型受体)ALK4/5[22]形成复合物。受体复合物的激活导致了细胞质传感器受体调控的SMAD 2/3 (R-SMAD)的磷酸化。磷酸化R-SMAD2/3二聚体活化SMAD4 (co-SMAD)形成三元复合物，一同转移到细胞核内[23]，与细胞核内特定的转录辅助因子共同调节靶基因转录[21]。

虽然活性Smad2和Smad3信号通路在颗粒细胞和肿瘤中的作用尚未确定，但大量小鼠突变体表明，在颗粒细胞中，Smad2和Smad3信号通路促进细胞增殖和肿瘤生长。例如，卵泡体细胞中激活素的缺失或smad2和smad3的缺失导致不育，但不会导致肿瘤的形成[20]。

另有研究报道，TGF- β可通过非SMAD信号通路激活ERK、JNK、p38 MAPK等MAPK激酶[24],而p38 MAPK在细胞凋亡、分化、存活、增殖、发育、炎症和应激反应中都有着重要的作用。在猪的相关研究中，磷酸化的p38 MAPK在MI-MII转化过程中调控卵母细胞减数分裂的恢复，在成熟过程中调控CCs的扩展。p38 MAPK激活的增加导致了壁颗粒细胞和CCs中表皮生长因子(EGF)样通路的激活[25]。在卵母细胞成熟末期，如Cox-2、孕激素受体(PGR)、副调节蛋白(EREG)和双调节蛋白(AREG)等EGF样肽的刺激可能启动卵丘细胞的扩张和排卵过程。还有研究表明p38 MAPK活性是小鼠胚胎植入前发育所必需的[2]。该研究在小鼠着床前发育过程中发现了PRAK、p38 MAPK、MK2和hsp25的mRNA表达和蛋白定位。还证明了激活的p38 a/h MAPK信号在8-16细胞阶段到囊胚阶段的发育过程中是必需的，p38 MAPK是着床前发育过程中丝状肌动蛋白的调节因子[26]。

也有研究表明，BMP亚家族成员GDF8通过激活SMAD3和ERK信号通路降低类固醇生成急性调节蛋白(StAR)的表达[27](在人类GCs中，卵母细胞衍生的BMP15通过下调StAR的表达来减少黄体酮的产生)。

GDF8和GDF11是两种具有相似结构和功能的密切相关的生长因子[32]，也是通过SMAD2/3蛋白以类似的方式发出信号。一般来说，生物反应的特异性主要由Ⅰ型受体决定，Ⅰ型受体以特定的SMAD蛋白为靶点，启动特定的下游信号级联[28]。尽管它们高度相似，但GDF11是SMAD2/3更强的激活因子，他能够通过Ⅰ型激活样受体激酶受体ALK4/5/7比GDF8更有效地发出信号，而活性的增强是由于Ⅰ型受体利用的差异。大量研究表明[8]，GDF8和GDF11均利用了Ⅰ型受体ALK4和ALK5，此外，GDF11还可以通过ALK7发出信号[29]，但GDF8是否也利用这种受体尚不清楚。

越来越多的证据表明，GDF8和GDF11两个配体可能在功能上是不同的，相比之下，GDF11似乎作用更广泛，然而，由于GDF11小鼠的胚胎致死率高，因此对GDF11在成年小鼠中的确切作用仍难以确定。此外，GDF8和GDF11的信号通路都受到细胞外蛋白拮抗剂的调控，包括FS、FSTL3、GASP1和GASP2[8]。

4 GDF8在常见家畜中的研究进展

GDF8的表达是近年来的研究热点。在人和牛中，GDF8在颗粒细胞和卵泡液中均有表达[28,30]，GDF8在鸡胚胎发生过程中广泛表达于鸡胚的各种组织，包括睾丸和卵巢[31]。然而GDF8对卵母细胞在家畜体外的成熟(IVM)和受精(IVF)作用研究较少。

表1 常见动物GDF8敲除的研究报道以及表型

4.1 猪

近年的一项研究确定了GDF8在猪卵母细胞体外成熟(IVM)中的作用。GDF8的表达与卵泡成熟呈正相关，卵泡越大，GDF8的表达量越高，这些都可能表明GDF8在卵母细胞成熟和卵泡形成过程中具有潜在的作用[2]。Yoon J D等[3]在IVM培养基中添加不同浓度(0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL)的GDF8来研究GDF8对IVM的影响，该研究首次证明GDF8可以作为旁分泌因子调节猪卵母细胞IVM过程中p38MAPK磷酸化和细胞内ROS水平的变化，激活的p38 MAPK信号改变了卵母细胞成熟和与卵丘扩张相关的基因转录:如卵母细胞中的基因 Nrf2 and Bcl-2；卵丘细胞中的基因PCNA,Nrf2,Has2,Ptx3,and TNFAIP6。他们还得出结论，体外受精期间使用GDF8可以提高成熟卵母细胞的质量，并恢复由于与卵泡环境分离所缺失的细胞内信号。该研究在IVM过程中补充100 ng/mL GDF8，导致GDF8拮抗剂FST mRNA表达水平的升高[2]，因此推测，不适当水平的GDF8补充剂所引起的过度信号会通过这些相互作用产生异常代谢，从而导致CCs中凋亡细胞信号的表达。

Yoon J D等[3]首次证实了GDF8存在于猪输卵管液中。GDF8对猪着床前胚胎的体外发育有显著影响。此外，在体外受精过程中，GDF8的补充调节了特定基因的转录模式和细胞系分化蛋白的水平，如实验组SOX2和CDX2明显增多。胚泡由内细胞团(inner cell mass,ICM)和滋养层( trophoderm，TE)组成，ICM产生整个胚体，TE分化为胎盘，CDX2表达在猪TE细胞中被特异性检测到。SOX2在猪胚泡中表达，它是一种多能性外胚层(EPI)标记。因此，该研究表明GDF8在IVC中的这些变化增强了IVF和PA后的胚胎着床前发育水平。

目前，仅有研究表明[37]GDF8基因双敲除猪存在后肢无力和跛行等缺陷，GDF8对猪生殖性能的影响尚缺乏系统的研究。这些基因如何编辑猪的繁殖性能？是否适宜用于大规模的的种用扩繁仍有待进一步研究。

4.2 牛

在牛的研究中，已经证明GDF8通过颗粒细胞表达，并可在小腔卵泡中检测到。此外，El-Magd M A等[16]通过监测成熟、IVF效率和卵裂率，探讨GDF8抑制剂MSTNP显微注射对水牛卵母细胞体外受精(IVF)及其潜在的发育能力的影响。发现GDF8能够显著降低细胞内活性氧(ROS)水平，而细胞内低ROS水平有助于细胞质的成熟和发育。因此，建议在IVM培养基中适当添加GDF8，以促进卵母细胞成熟，提高后续发育能力。虽然活性氧(ROS)的产生是细胞代谢的正常过程，这也已被认为是造成细胞损伤的主要原因。此外，ROS在卵母细胞体外成熟(IVM)中的作用及其对胚胎发育的影响仍存在争议。有人认为ROS可能参与了卵母细胞的减数分裂阻滞，并且已经被认为是胚胎发育停滞和细胞死亡的主要原因[8]。

Luo J等[38]结合 ZFN 和 SCNT 获得双等位基因敲除牛，这些克隆牛在1月龄时就出现了肌肉肥大的双肌臀表型。此外，该基因在牛上的研究主要集中于GDF8单核苷酸多态性，以及这些多态性与双肌肉表型的相关性，从而进一步改进育种计划。

5 GDF8在人卵巢中的研究

来自临床的研究数据显示GDF8可能参与人类某些生殖疾病过程，如子宫肌瘤、子痫前期和多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)[5]。比如GDF8的过度表达可能与PCOS的各种表型相关的排卵功能障碍、卵泡生长停滞和代谢紊乱有关。这些均表明GDF8可能在调节卵巢卵泡功能和发育中发挥功能作用[19]。

Chang H M等[28]首次证明GDF8在人颗粒细胞和卵泡液中表达，16个卵泡液样品中含有平均浓度为3 ng/ml的GDF8蛋白。GDF8通过ACVR2A/ACVR2B-ALK5介导的SMAD2/3依赖性信号转导下调了人颗粒细胞PTX3的表达从而调节卵巢功能。

事实上，PTX3在卵丘细胞中的表达水平已被证明与相应卵母细胞的质量和受精率呈正相关，患多囊卵巢综合征的女性血清GDF8浓度高于无多囊卵巢综合征的女性。因此，这些数据都表明GDF8下调PTX3的表达，抑制卵丘的扩张，从而导致PCOS患者排卵功能障碍。在正常生理条件下，GDF8可能被认为是颗粒细胞分泌的卵丘扩张抑制因子[28]，能够在排卵前维持卵丘减数分裂停止。

此外，GDF8可以通过上调FSH受体(FSHR)表达来增强GC对FSH的响应性，下调LHR表达来抑制GC对LH的响应性。除了GDF8在调节类固醇产生方面的作用外，一项体外研究表明GDF8抑制人类GC增殖。这种负调控作用是由另一种生长因子，结缔组织生长因子(CTGF)介导的，提示GDF8和CTGF可能参与了对人类卵泡发育过程中高度增殖和非增殖事件的调控[39]。

Lysyl氧化酶(LOX)是卵泡和卵母细胞成熟所必需的细胞外基质最终组装和转化的关键酶。在大鼠卵巢中，LOX表达水平与卵母细胞质量呈正相关。在许多器官中，CTGF是细胞外基质相关组织重构的主要介质。CTGF和LOX均在人GCs中表达，CTGF介导GDF8诱导的LOX活性增加和LOX蛋白表达。有趣的是，GDF8诱导人GCs CTGF表达上调是通过ALK5介导SMAD2/3-SMAD4信号通路发生的。这一发现与之前的研究不一致，在小鼠C2C12成肌细胞中，GDF8信号主要依赖于ALK4，而非ALK5，表明I型受体介导的GDF8下游信号具有细胞特异性[40]。其中，GDF8在成肌细胞中通过ALK4作用，而ALK5在非成肌细胞中介导GDF8诱导的细胞作用。在卵泡微环境中，局部产生的GDF8促进芳香化酶/雌二醇和FSHR的表达，抑制StAR /孕酮和LHR的表达并下调PTX3的表达。 此外，GDF8诱导CTGF的表达，这有助于抑制GC增殖和增加LOX活性[39]。

6 展望

以往关于GDF8的研究主要集中在其对肌肉的负调控作用上，从而筛选出具有优良性状的品种，更好的进行育种。现在的研究不仅集中在卵母细胞成熟调控上，还有许多GDF8与GDF11的对比研究，现在的研究也有关于GDF11和GDF8在衰老中的潜在代谢作用，发现给予外源性rGDF11，而不是rGDF8，可以减少饮食诱导的体重增加，改善代谢稳态。由于GDF8和GDF11的同源性很高，GDF11与GDF8有90%的氨基酸序列同源性，因此也有研究运用靶向方法区分和测定小鼠血清中GDF8和GDF11的绝对水平，采用一种基于LC-MS/MS平行反应监测结合免疫沉淀的检测方法，能可靠地鉴别GDF11和GDF8，并测定其在小鼠血清中的内源性水平。结果发现，雌性小鼠的GDF11和GDF8循环水平均随年龄增长而显著下降。人们期待有更多的研究来解释GDF11和GDF8在卵母细成熟调控机制上的差异。

此外，目前的研究缺乏GDF8对COCs中一些重要的IVM相关基因如GDF9、BMP15的表达的影响。GDF9和BMP15是在卵母细胞成熟过程中表达的重要的卵母细胞分泌因子。需要进一步的研究来确定GDF8、GDF9和BMP15实际的分子机制，以及它们在IVM和随后的发育阶段如何协作。

GDF8在人的研究方面主要集中与GDF8与多囊卵巢综合征的关系，有研究表明，卵泡液中高水平的GDF-8与多囊卵巢综合征体外受精患者的低妊娠率有关，在人的研究中证明了PCOS患者卵泡液中GDF-8的异常表达会导致P4的异常表达，从而导致不良妊娠结局。

因此，全面地了解TGF-β超家族中卵母细胞分泌因子在哺乳动物卵巢中的生理作用，将为卵巢病理学研究提供重要的见解，并为研究生育调节提供新的方法，无论其目标是开发替代性的对抗性形式、诊断和治疗人类不育，还是在人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)，体外受精胚胎培养系统中开发出更安全可靠的方案都有很重要的意义[39]。另一方面，对卵巢内卵泡因子调节机制的研究也有助于开发新的方法来监测和控制卵巢功能，为提高家畜、濒危物种和人类的生育能力提供新的线索。