钩吻素子和钩吻素己对轻度认知功能障碍模型小鼠的影响

唐模欢，王千诩，张华海，刘兆颖*

(1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；2.湖南省兽药工程技术研究中心，湖南长沙 410128；3.西北农林科技大学，陕西杨凌 712100)

钩吻又名大茶药、大茶叶、断肠草等，为马钱科(Loganiacease)植物胡蔓藤(GelsemiumelegansBenth,GEB)的全草，虽是世界著名的剧毒植物，但其药理作用也不可忽视，在中国古代就有医书记载着钩吻的临床应用，在传统用法上，钩吻常被用于治疗机械性疼痛、神经疼痛、焦虑、失眠、呼吸道疾病和癌症等[1-3]。研究表明钩吻的粗提取物和生物碱成分具有抗肿瘤、抗痉挛、镇痛、镇静和抗焦虑等多种生物学功能[4-5]。

钩吻其所含成分众多，有环烯醚萜类、生物碱、淄体、香豆素等，其中生物碱成分是钩吻的主要活性成分，大约就有120多种已经被分离鉴定[6]。钩吻生物碱单体成分中钩吻素子是所能提取到的含量最高的单体成分[7]，其毒性相对较低的药理研究，表明具有良好的潜在抗焦虑作用[8]。而钩吻素己[9]是钩吻单体生物碱成分中已知毒性最强的一种单体成分，半数致死量(LD50)为18 μg/kg[10]。钩吻素己中毒后在消化道中迅速分布造成动物胃部痉挛，但在钩吻生物碱成分中，钩吻素己对肝癌细胞HepG2的增殖抑制活性最好，同时也被证实可作为良好的慢性疼痛治疗药物[11-13]。

长期的焦虑情绪可以成为轻度认知功能障碍疾病的诱因[8]。正因为钩吻素子对焦虑症等具有一定的治疗作用[1,14-15]。而目前尚未有钩吻素己在轻度认知功能障碍方面的研究，故选取钩吻生物碱中最具有潜力开发成抗焦虑药物的单体成分钩吻素子和毒性最大的单体成分钩吻素己，探究钩吻生物碱对东莨菪碱诱导的认知功能障碍疾病是否具有保护作用，观察这2种单体成分对小鼠的动物行为变化，同时探讨钩吻素己对脑部海马组织的损害作用，对钩吻在神经方向的药理机制完善和突破有重要参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠，24只，雄性，体重20 g±5 g，购于西安交通大学医学院动物实验中心。

1.1.2 主要试剂 钩吻素子、钩吻素己，成都曼思特生物科技有限公司产品；氢溴酸东莨菪碱，美国AbMole有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 动物行为学视频分析系统(SuperMaze)，上海欣软信息科技有限公司产品；大小鼠Morris水迷宫实验仪器(XR-XM101)，上海SuperMaze有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试剂的制备 将钩吻素子和钩吻素己粉末用9 g/L氯化钠注射液分别配制成浓度为10 mg/kg、20 μg/kg的溶液。东莨菪碱在行为学试验开始前1 h配置，现配现用，配制方法参考高莉的报道[14]，同样用9 g/L氯化钠注射液配制成浓度为3 mg/kg的溶液，制备后放置4℃冰箱冷冻保存，以待实验进行时腹腔给药。

1.2.2 小鼠的分组与给药 将24只C57BL/6雄性小鼠随机分4组，即对照组、钩吻素子组、钩吻素己组和模型组，每组6只。对每组小鼠进行称重记录初始重量，对照组和模型组腹腔注射等容积生理盐水，钩吻给药组每只小鼠按体重 0.1 mL/10 g腹腔注射钩吻素子，10 mg/kg；钩吻素己，20 μg/kg，连续给药12 h，每天上午9:00开始给药。每天给药后观察小鼠的活动情况，是否有死亡。

1.2.3 轻度认知障碍小鼠模型的建立 从钩吻干预性给药第8天开始至第12天，造模周期为5 d，每天钩吻给药结束后1 h，除对照组外各试验组均一次性腹腔注射东莨菪碱3 mg/kg，注射体积为0.2 mL/10 g，构建轻度认知障碍小鼠模型[16]。且每天造模结束后0.5 h开始进行水迷宫试验观察各组小鼠行为学变化，水迷宫实验周期为5 d。

1.2.4 Morirs水迷宫试验 Morirs水迷宫[17]试验检测空间记忆能力：将Morris水迷宫水温控制在22℃～24℃，分为4个象限。平台直径7 cm，高30 cm，随机放置在一个象限的中央。水池中注水，高出平台约1 cm。试验进行5 d，前4 d进行定位航行试验，测小鼠学习记忆获取的能力，记录小鼠到达平台所需时间即逃避潜伏期。第5天进行空间探索试验，测小鼠对学习记忆的重现能力，记录小鼠穿越平台的次数及所在象限停留路程。

1.2.5 组织取样 当水迷宫试验测试结束后，立即将小鼠处死，在冰盒上解剖小鼠，取小鼠脑部海马组织，并置于-80℃保存。

1.2.6 病理组织学观察 取钩吻素己组小鼠海马组织进行HE染色，通过取材、脱水、包埋及切片程序制备好石蜡切片，观察小鼠脑部海马组织形态学是否有损伤。

2 结果

2.1 小鼠水迷宫试验结果

行为学检测指标包含到达平台花费的时间；平台所在象限停留时间；平台所在象限运动路程。定位航行实验结果见图1，第1天对照组、模型组和钩吻给药组小鼠逃避潜伏期均没有明显差别；第3天后，与对照组相比模型组的逃避潜伏期随着训练次数增加而增加，钩吻素己和钩吻素子组随训练次数的增加，逃避潜伏期变化不明显。第5天后，随着训练次数的增加，模型组与对照组相比逃避潜伏期变化高度显著，随着训练次数增加，钩吻素子组与模型组相比，逃避潜伏期明显减少。经单因素方差分析可知，第3天模型组逃避潜伏期较对照组显著增加(P<0.05)，第5天模型组逃避潜伏期较对照组增加呈现高度显著(P<0.01)，提示模型组造模成功。第5天钩吻素子组逃避潜伏期较模型组显著减少(P<0.05)，提示钩吻素子组小鼠较模型组学习记忆能力好。

A.对照组；B.东莨菪碱组；C.钩吻素子组；D.钩吻素己组

空间探索结果如下，穿越平台次数见图2，对照组小鼠穿越原平台次数最多，模型组显著少于对照组(P<0.05)，钩吻素子和钩吻素己组介于模型组和对照组之间，其中钩吻素子组效果最好，与定位航行实验结果一致，提示钩吻素子对学习记忆是有影响作用的。平台所在象限停留路程百分比见图3，模型组小鼠较对照组在平台所在象限的路程显著减少(P<0.05)，而钩吻素子组较模型组所在平台象限的路程又显著减少(P<0.05)，提示钩吻素子对小鼠的学习记忆有影响。

A.对照组；B.东莨菪碱组；C.钩吻素子组；D.钩吻素己组

A.对照组；B.东莨菪碱组；C.钩吻素子组；D.钩吻素己组

2.2 小鼠海马组织病理学变化结果

钩吻素己组和对照组小鼠海马区进行HE染色，结果如图4。

从图4可以看出，钩吻素己组与对照组相比，海马CA1和CA3 区细胞固化萎缩，整个细胞深染；CA3区的细胞数量变少，但细胞坏死的数量增多。提示钩吻素己对东莨菪碱造成的轻度认知记忆障碍是有不具备保护作用的。而小鼠的海马齿状回(DG)区的细胞变化不明显。但相比对照组来说，钩吻素己组队海马前额叶皮层(PC)的损伤明显，2个组对比，钩吻素己组PC区细胞数量减少，同时坏死细胞增多。

3 讨论

采用东莨菪碱构建轻度认知功能障碍小鼠模型是常见的记忆损伤模型，东莨菪碱能够干扰小鼠的空间参考记忆和空间工作记忆，与水迷宫试验结合[18-19]，能有效探究钩吻生物碱对认知功能障碍的影响[20]。该模型的造模方法十分简便，腹腔注射东莨菪碱可以引起胆碱能系统功能障碍，亦可造成动物的学习记忆能力下降，使其出现认知记忆障碍等症状。本实验造模参考高莉对东莨菪碱不同给药剂量对小鼠学习记忆的影响，来建立东莨菪碱轻度认知功能障碍小鼠模型和确定给药剂量[14]。结果显示，在水迷宫试验的定位航行阶段中，模型组小鼠较空白组，小鼠的逃避潜伏期出现显著延长，这与文献报道一致[21]。说明在探索钩吻对小鼠认知功能障碍的行为试验中造模是成功的。

钩吻素子是钩吻中含量最高的单体成分，并且具有很多药理作用，如抗焦虑、抗肿瘤、镇痛等，但在学习记忆方面的机制还没有完善的研究。而钩吻素己是钩吻毒性最强的生物碱成分，应用到药物治疗上一直研究难点。很多研究表明，出现认知功能障碍的其中重要机制是由于大脑中胆碱能神经元细胞数量的逐渐减少，引起乙酰胆碱的含量的逐渐降低，从而导致学习记忆功能的减退。钩吻素子和钩吻素己都能通过血脑屏障进入大脑，故本实验结合钩吻的临床使用经验和药理研究进展，探讨钩吻素子和钩吻素己两种生物碱成分对小鼠大脑认知功能的预防保护作用。本研究在水迷宫试验中，由图1可知在钩吻素子作用下，小鼠的逃避潜伏期较模型组显著减少，这说明钩吻素子在给药一段时间后可以保护小鼠在认知方面免受东莨菪碱损伤。而钩吻素己在水迷宫试验中对小鼠轻度认知功能的保护作用不明显，通过对海马组织的HE染色观察，发现在该给药剂量下，钩吻素己造成小鼠脑部海马区的CA3和PC区的细胞数量变少，坏死增多。而海马组织是与学习记忆能力相关的重要区域，海马组织细胞神经元受到损伤则会加重记忆功能下降，造成认知功能障碍[22]。由此推测，由于小鼠组织海马细胞被钩吻素己的毒性影响，其不具有认知功能保护作用。

认知功能损伤是神经类疾病如焦虑症、抑郁症、阿尔兹海默症等常见的临床表现，而其中的学习记忆力受损又是认知功能障碍中较为常见的一种表现[18-19,23-24]。而钩吻生物碱既然能表现出抗焦率、抗抑郁症活性，理论上也能够对学习记忆受损具有保护作用，通过实验初步验证了本研究的推断是合理的，钩吻生物碱成分的钩吻素子对小鼠东莨菪碱引起的认知功能障碍具有保护作用。

综上结果，本研究从钩吻传统应用中了解到钩吻对焦虑、抑郁方面疾病具有治疗效果，并通过一系列实验来验证钩吻对认知功能障碍的推测是合理的，初步证实钩吻素子可以预防东莨菪碱引起的轻度认知功能障碍，改善动物的行为和学习记忆能力，表现出保护性神经作用，为钩吻素子在今后作为一种良好的认知功能障碍保护性药物提供参考。