豨莶精醇对免疫性血小板减少症的网络药理学与实验研究

徐丽伟，周凯旋，薛嘉宝，辛 国，李丽静*

（1.长春中医药大学附属医院，长春130021；2.长春中医药大学，长春130117）

免疫性血小板减少症（ITP）是一种由于血小板自身免疫性破坏，外周血中血小板减少的自身免疫性出血性综合征[1]，主要临床表现为皮肤黏膜瘀点、瘀斑、月经量多、尿血，严重者可因颅内出血而危及生命[2]，在临床上常用地塞米松进行治疗，抑制患者免疫功能，恢复细胞亚群间的平衡[3]。豨莶草是菊科植物豨莶（Siegesbeckia orientalis L）、腺梗豨莶（Siegesbeckia pubescens Makino）和毛梗豨莶（Siegesbeckia glabrescens Makino）的干燥地上部分，性寒，味辛、苦，归肝、肾经，可利关节、抗血栓、解毒、祛风湿等[4]，研究显示，豨莶草对关节肿痛具有良好的治疗作用，具有一定的免疫抑制作用[5]，豨莶精醇是豨莶草中的有效成分[6]，在实验研究中，发现其具有一定的抗炎、调节免疫的作用[7]。本文通过网络药理学的方法，构建化合物-靶点-疾病网络，分析豨莶精醇对免疫性血小板减少症的作用及作用机制，并通过细胞实验对其作用进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 豨莶精醇靶点预测

通过Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索豨莶精醇的化合物结构，复制Isomeric SMILES号至SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测。

1.2 ITP靶点获得

使用GeneCards数据库（https://www.genecards.org）以“Immune Thrombocytopenia”为关键词对疾病的靶点进行检索，并使用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）对靶点进行蛋白标准化。

1.3 化合物-靶点-疾病网络的构建

应用Cytoscape3.5.0软件，将共有靶点基因导入，绘制化合物-靶点-疾病互作网络图并对共有靶点基因进行汇总。

1.4 基因富集分析

利用DAVID6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对上述筛选出的共有靶点进行基因本体（Gene ontology,GO）生物过程分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析。并选取前20个基因，使用易汉博生物信息在线作图（www.ehbio.com）进行气泡图的绘制。

1.5 蛋白质相互作用网络和关键靶点的获取

运用STRING数据库（https://string-db.org/），将共有靶点基因导入，对Organism限定为homo sapiens，进行蛋白质相互作用分析，并选取三个参数（Degree、Betweenness和Closeness），设定条件为Degree大于中位数的2倍，Betweenness和Closeness大于中位数，所获得的靶点为关键靶点蛋白。

1.6 豨莶精醇对刀豆蛋白诱导的脾细胞影响

1.6.1 动物

SPF级雄性Balb/C小鼠，体重为18～22g，6～8周龄，购于辽宁长生实验动物技术有限公司，合格证号:SCXK(辽)-2020-0001。

1.6.2 试剂与仪器

豨莶精醇 （B21355，上海源叶生物科技有限公司）；刀豆蛋白A（ConA）（C8110，北京索莱宝科技有限公司）；RPMI 1640培养液（31800，北京索莱宝科技有限公司）CCK-8试剂盒（KR675，同仁化学研究所）；胎牛血清（1861242，购于Gibco）；二氧化碳培养箱（311，ThermoFisher）；酶标仪（EPOCH，Bio-Tek）。

1.6.3 脾细胞的制备

小鼠断颈椎处死，超净台中无菌取脾脏。取出的脾脏用D-Hank's液冲洗3次，在D-Hank's液的培养皿中，用5 mL注射器柄研磨脾脏，使用200目的钢筛过滤，1000 rpm离心5 min，弃上清，加入红细胞裂解液静置3min，去除血红细胞，D-Hank's洗3次，离心弃上清，含10%胎牛血清RPMI 1640培养液重悬。

1.6.4 脾细胞增殖活性检测

在96孔板接种脾细胞悬液，细胞数量5000/孔，并将细胞分为正常组 （10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液），模型组 （5mg/L的ConA+10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液），豨莶精醇低剂量组（5mg/L的ConA+10μmol/L豨莶精醇+10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液），豨莶精醇高剂量组 （5mg/L的ConA+20μmol/L豨莶精醇+10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液）。每组5个复孔，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48h后，每孔加入10μL的CCK-8试剂，继续培养1h后，用酶标仪检测各孔450nm处的吸光值。

1.6.5 统计学方法

实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靶点收集结果与网络构建

通过对豨莶精醇进行预测，共获得靶点112个，收集获得ITP相关靶点3759个，通过构建化合物-靶点-疾病网络，获得共有靶点56个，详见图1。

图1 豨莶精醇与ITP网络图

2.2 GO生物学过程分析

在DAVID6.8数据库对豨莶精醇和ITP共有的靶点基因进行GO生物学过程分析，结果以P值升序排列，取前20个条目，进行分析绘制气泡图，豨莶精醇治疗ITP的生物学过程主要涉及调节多个蛋白通路的磷酸化、调节一氧化氮的合成、调控JAK-STAT级联、调控细胞的增殖凋亡和迁移等，详见图2。

2.3 KEGG通路分析

对豨莶精醇和ITP共有的靶点基因进行KEGG通路富集分析，结果以P值升序排列，取前20个条目进行分析，绘制KEGG通路富集分析气泡图，豨莶草治疗ITP的通路主要涉及癌症的途径、催乳素信号通路、PI3K-Akt信号通路、ErbB信号通路、胶质瘤、白细胞跨内皮迁移、FoxO信号通路、GnRH信号通路等，详见图3。

图3 豨莶精醇和ITP的KEGG通路分析

2.4 蛋白质相互作用网络及关键靶点

在STRING数据库导入获得的56个共有靶点基因，得到蛋白质相互作用网络，详见图4，通过对蛋白质相互作用网络进行分析，获得5个作用网络的关键靶 点 ， 分 别 为STAT3、EGFR、ESR1、HSP90AA1、MAPK8，详见表1。

图4 共有靶点蛋白质相互作用网络

表1 关键靶点蛋白

2.5 豨莶精醇对脾细胞增殖的影响

使用ConA诱导脾细胞后，相较于正常组，模型组对脾细胞有显著的增殖作用（P＜0.01），而加入豨莶精醇后，与模型组比较，豨莶精醇对ConA诱导的脾细胞增殖具有一定的抑制作用，且抑制作用与给药剂量呈现一定的正相关性（P＜0.05，P＜0.01），见表2。

表2 豨莶精醇对脾细胞增殖的影响（n=5,x±s）

3 讨论

通过网络药理学对豨莶精醇在ITP的治疗机制进行研究，发现其机制涉及到多个方面，具有多靶点，多通路的特点。富集分析结果表明，豨莶精醇可通过影响蛋白质的磷酸化，进而调节机体的细胞的增殖、凋亡、迁移，并对一氧化氮的合成具有调节作用，一氧化氮对平滑肌细胞增生、血管张力、细胞免疫、细胞毒等具有调节作用[8]。发挥这些作用涉及了多条通路，催乳素是一种垂体肽激素，通过它可以对细胞增殖、分化和细胞存活产生影响进而调节多种生理功能[9]，ITP中可以通过调节PI3K-Akt信号通路，控制mTOR来进行血小板自噬的调控，研究表明，增强血小板自噬功能可减轻血小板破坏[10]，活化的Akt可使FoxO蛋白受到抑制，调节FoxO信号通路，进而调控Treg细胞的增殖，在ITP的治疗中具有重要作用[11]。在关键靶点中，处于第一位的STAT3在免疫细胞中，活化的STAT3可导致免疫介质的抑制和免疫抑制因子的促进[12]，对ITP的治疗具有积极的意义，表皮生长因子受体（EGFR）在免疫过程中有着重要作用，通过调节EGFR的表达[13]，对ITP的治疗同样具有积极的意义MAPK8在治疗免疫相关疾病中同样具有积极的作用，通过调节该靶点，进而可以调节Th1、Th2细胞和巨噬细胞[14]，发挥治疗作用。脾脏是免疫应答的重要场所和重要调节器官，含有多种免疫细胞与细胞因子，主要的免疫细胞是淋巴细胞[15]，在临床中，ITP患者常有脾脏增生的表现，可采用脾部分切除的方法进行治疗[16]，细胞实验显示，豨莶精醇对ConA诱导的脾细胞增殖具有一定的抑制作用，表明了其在临床应用上的潜力。

综上所述，豨莶精醇对ITP的治疗是通过影响多个生理过程来发挥治疗作用的，本研究通过网络药理学的方法，探究了豨莶精醇对ITP治疗的作用机制，为后续深入实验研究提供了较为可靠的理论基础。