猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、支原体混合感染病例的实验室诊断

成虹松，李 梅，方 天，宋 春，陈 静，杨 鹏，尹德晶，张双翔，程振涛*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起猪的高度接触传染性疾病，世界各地均有发生，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病；被感染的野猪种群可作为病毒的储藏库，对家猪构成潜在威胁，严重危害养猪业[1]。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的急性、高度传染性疾病，能导致怀孕母猪在妊娠后期出现早产、流产或产死胎等繁殖障碍，并可引起新生仔猪呼吸系统症状[2]。猪支原体肺炎(MPS)是由猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)引起的以气喘为主要症状及肺部对称性“肉样变”为主要病理变化的慢性接触性呼吸道传染病，在世界各地普遍存在[3]。2020年9月初贵定县某猪场2头猪发病，主要表现腹泻、呼吸困难、皮肤紫斑、厌食、弓背、精神沉郁等症状。根据流行病学调查及临床症状怀疑为多病原混合感染，特采集病料进行实验室检测诊断，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 检测病料无菌采集该养殖场2头发病猪的肺脏、肝脏、扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏组织样品作为检测病料。

1.2 主要试剂DNA/RNA提取试剂盒、猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒、支原体PCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨公司)；2 000 bp DNA Marker(购自大连宝生物工程有限公司)；鲜血琼脂培养基(由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室提供)。

1.3 主要仪器SYGENE 电泳凝胶成像仪(GENE公司)、台式高速冷冻离心机(ScanSpeed 1730R，丹麦LABOGENE公司)、迷你离心机(MINI，丹麦ScanSpeed公司)、-20 ℃冰箱(BCD-215KCF)、可调节微量移液器(0～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL，德国Eppendorf公司)。

1.4 细菌分离培养在无菌条件下将肝脏样品分别接种于鲜血琼脂培养基，37 ℃恒温箱培养24 h，观察菌落生长情况。

1.5 相关病原核酸提取分别取2头病猪肺脏、肝脏、扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏组织，每份组织分别从3个不同位置称取样品约1 g，用手术剪剪碎混匀后取0.5 g于研磨器中，加入生理盐水1.5 mL研磨，匀浆后转至1.5 mL灭菌离心管中，8 000 r/min离心2 min，取上清，用DNA/RNA试剂盒按说明书方法提取总DNA和RNA。

1.6 病原核酸检测

1.6.1 猪瘟病毒核酸检测以提取的总RNA为模板，构建RT-PCR反应体系20 μL：RT-PCR反应液16.8 μL，酶混合液1.2 μL，模板RNA 2 μL。反应程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，循环35次；72 ℃延伸10 min。取RT-PCR产物10 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，于凝胶成像系统观察结果(预扩增片段235 bp)。

1.6.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测以提取的总RNA为模板，构建RT-PCR反应体系20 μL：RT-PCR反应液16.8 μL，酶混合液1.2 μL，模板RNA 2 μL。反应程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次；72 ℃延伸7 min。取RT-PCR产物10 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，于凝胶成像系统观察结果(预扩增片段436 bp)。

1.6.3 支原体核酸检测以提取的总DNA为模板，构建PCR反应体系20 μL：PCR反应液16 μL，TaqDNA聚合酶2 μL，DNA模板2 μL。反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环35次；72 ℃延伸10 min。取PCR产物10 μL混合上样缓冲液2 μL，点样于1.2%琼脂糖凝胶上电泳，于凝胶成像系统观察结果(预扩增片段602 bp)。

2 结果

2.1 细菌分离培养培养基上未见菌落生长，说明无细菌感染。

2.2 猪瘟病毒核酸检测由图1可见：2份样品经过RT-PCR扩增，均出现235 bp的猪瘟病毒特异性条带，提示2头病猪均存在猪瘟病毒感染。

M：2 000 bp分子质量标准； +：阳性对照； -：阴性对照； 1～2：检测样品图1 猪瘟病毒RT-PCR扩增结果

2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测由图2可见：经过RT-PCR扩增，1号样品未出现特异性条带，2号样品出现436 bp的猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性条带，提示2号病猪存在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。

M：2 000 bp分子质量标准； +：阳性对照； -：阴性对照； 1～2：检测样品图2 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR扩增结果

2.4 支原体核酸检测由图3可见：经过PCR扩增，2份样品均出现602 bp的支原体特异性条带，提示2头病猪均存在支原体感染。

M：2 000 bp分子质量标准； +：阳性对照； -：阴性对照； 1～2：检测样品图3 支原体PCR扩增结果

3 结论

通过相关病原核酸检测，确诊病猪存在猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、支原体混合感染。

4 讨论

4.1近年来随着养猪业的规模化发展，猪感染的病原越来越复杂，多种病原混合感染的情况也越来越严重，病猪的治疗变得愈发困难。猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染，猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒混合感染，甚至多种病毒混合感染的病例常有报道[4～6]。除了病毒引起的混合感染外，也有细菌或其他病原的混合感染，如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、链球菌、沙门氏菌混合感染[7，8]。本次检测结果显示该猪场存在猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、支原体混合感染。

4.2为预防猪病的发生，猪场要做好防控措施，采取“预防为主，养防结合”的方针，做好猪场的免疫及防疫工作，根据猪场的流行病学调查和实际情况制定合理的疫苗免疫程序。引入仔猪和种猪时需要严格按照引种程序进行检疫和隔离观察，避免引入病猪或携带病原的猪，给猪场带来生物安全隐患。其次要加强猪场的管理，加强对饲料营养及安全性的重视，避免由于病原污染饲料而导致猪群感染。猪群管理进行细化分类，定期检疫监测，发现疫情及时处理和净化，保障猪群的卫生安全。