不同干预治疗对PCOS大鼠血管生成素样蛋白2表达的影响

王丹丹 柴淑娟 郭秋炎 卫项龙 郭艺红 申 科 李艳春 赵瑞钦

1 河南中医药大学第三附属医院，河南省郑州市 450008；2 舞阳县妇幼保健院生殖科; 3 郑州大学第一附属医院

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄期女性最常见的内分泌代谢紊乱疾病之一，临床表现高度异质性，表现为月经紊乱、无排卵或稀发排卵、雄激素过多、不少患者伴有胰岛素抵抗、血脂代谢异常等[1]，严重影响育龄期女性患者的生活质量。目前其病因尚未阐明，深入探讨PCOS的生理病理改变及其可能分子机制，寻找治疗和预防的新靶点，一直是生殖内分泌研究的热点。

多数观点认为全身和卵巢组织局部胰岛素抵抗(IR)的存在[2]是PCOS发生、发展的关键病理机制，导致卵巢功能紊乱及排卵异常。PCOS卵巢局部IR主要是因为胰岛素信号转导通路障碍，可能与胰岛素、PI3K及葡萄糖转运蛋白4信号转导关键分子受损有关[3-4]。L磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)是一个重要的胰岛素信号转导通路，PI3K/AKT信号通路磷酸化减少是PCOS患者胰岛素抵抗(IR)的主要特征。卵泡的发育过程不仅需要激素、信号转导的调节，新生血管提供充足的营养也是卵泡发育所必需的。血管生成样蛋白(Angioprotein-like protiens,ANGPTLs)是一类血管生成相关的分泌性糖蛋白，与血管发生关系密切。目前多数研究认为脂肪组织中的ANGPTL2能够介导脂肪组织慢性炎症的发生，促进与肥胖相关的IR[5]。但对于PCOS患者ANGPTL2是否通过PI3K/AKT信号转导途径来介导卵巢组织局部IR从而影响卵泡的发育目前尚未见相关的报道。

本实验研究通过来曲唑建立PCOS大鼠动物模型，应用二甲双胍和中药分别进行干预，通过适时荧光定量聚合酶链反应(Qrt-PCR)检测PCOS大鼠和中西医干预治疗后的卵巢组织中的ANGPTL2、PI3K、AKT以及Foxol的mRNA差异性表达，探讨ANGPTL2是否通过PI3K/AKT信号途径来影响卵泡的发育及ANGPTL2与PCOS和胰岛素抵抗的相关性，同时探讨中西医不同干预治疗对ANGPTL2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 选21d龄雌性SD清洁级大鼠60只，体质量180～200g，由郑州大学动物实验中心提供，生产许可证号：SYXK(豫)2015—0005。2019年4—5月底在河南中医药大学第三附属医院动物实验中心饲养，标准饲料喂食。60只SD大鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法分为空白对照组(NC)10只和实验组50只，空白对照组给予常规饲料喂养，饮水及食物自由摄取，实验组待造模完成后重新编号根据随机数字表法将大鼠分为模型对照组、西药组、中药组(高浓度中药组、低浓度中药组)、中药+西药联合用药组各10只，实验过程中饮水及食物自由摄取。

1.2 主要实验药物制备 来曲唑(芙瑞)，羧甲基纤维素(sigma公司提供)。补肾化瘀方(沙苑子、枸杞子、菟丝子、茺蔚子、泽兰、泽泻、土鳖虫、丹皮、甘草)药物由河南中医药大学第三附属医院中草药房提供，药物煎制与浓缩由河南中医药大学第三附属医院药剂科按照操作标准进行，根据人与大鼠之间用药剂量换算系数公式(大鼠剂量=6.3×人的剂量mg/kg)换算实验给药剂量。二甲双胍组4.498mg/ml(等效剂量换算)；补肾化瘀方高浓度组(2倍等效剂量)1.98g/ml，中浓度组(1倍等效剂量)0.989g/ml，低浓度组(1/2倍等效剂量)0.494 5g/ml。

1.3 实验方法 实验组大鼠灌胃服用来曲唑1mg/(kg·d)溶于1%羧甲基纤维中，连续灌胃21d，自造模1周后开始每天观察大鼠阴道脱落细胞涂片。造模结束后次日开始给药：空白对照组和模型对照组给予生理盐水0.01ml/(g·d)灌胃；西药组给予二甲双胍溶液0.01ml/(g·d)灌胃；中药组分别给予高浓度和低浓度补肾化瘀方0.01ml/(g·d)灌胃；中西医组分别给予二甲双胍溶液0.01ml/(g·d)和中浓度补肾化瘀方0.01ml/(g·d)灌胃，连续灌胃21d。大鼠灌胃21d后，当晚8：00禁食，次晨8：00称重后10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血5～8ml，静置30min后离心得到血清，-80℃冻存备用。取大鼠双侧卵巢组织，一只迅速投入液氮中，2h后置于-80℃冰箱冻存备用，另一只卵巢组织固定于体积分数4%多聚甲醛中以备后续试验用。

1.4 指标检测

1.4.1 血清胰岛素水平：采用酶联免疫法(ELISA)检测血清胰岛素水平，按试剂盒说明书步骤进行。

1.4.2 卵巢组织中ANGPTL2、AKT、Foxol mRNA表达情况：采用研磨法提取mRNA，测定浓度和纯度，按照反转录试剂盒说明书配制反转录体系20μl，反转录条件：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 30s，60℃ 30s，40个循环。PCR扩增引物核苷酸序列见表1。

表1 PCR扩增引物核苷酸序列表

1.4.3 卵巢组织中ANGPTL2、AKT、Foxol 蛋白表达情况：采用Westen-blot 法检测卵巢组织中ANGPTL2、AKT、Foxol 蛋白表达水平。提取卵巢组织中总蛋白，测定蛋白浓度，根据总蛋白浓度计算样品蛋白浓度，将提取的蛋白上清完全变性后-20℃保存。用微量加样器将制备好的蛋白样品和MAKER加入上样孔电泳，各样品总蛋白量为40μg。在转模槽内将蛋白转印至PVDF膜内，然后免疫印迹染色，晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

2 结果

2.1 各组大鼠血清胰岛素含量 与空白对照组相比，其余各组大鼠血清胰岛素含量显著升高(P<0.05)；与模型对照组相比，各治疗组血清胰岛素水平明显下降(P<0.05),以中西药联用效果最佳,见表2。

表2 各组大鼠血清胰岛素含量

2.2 各组大鼠卵巢组织中ANGPTL2、AKT、Foxol mRNA及蛋白表达水平 与空白对照组相比，模型对照组、中药组及中药+西药组大鼠卵巢组织中ANGPTL2、AKT、Foxol mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与模型对照组相比，各治疗组大鼠卵巢组织中ANGPT L2、AKT、Foxol mRNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05),西药组效果最佳，见表3、图1。

表3 各组大鼠卵巢组织中ANGPT L2、AKT、Foxol mRNA表达水平

图1 各组大鼠卵巢组织中ANGPTL2、AKT、Foxol蛋白表达水平

3 讨论

目前多数学者认为PCOS是IR相关的代谢综合征，会导致不孕、胰岛素抵抗、肥胖和心血管等一系列健康问题，严重影响了育龄期女性生活质量，其发病原因和机制复杂，研究表明IR 对PCOS患者的生育和代谢功能有显著的影响，特别是伴有肥胖者，这种影响更大[6]。

血管生成素样蛋白2(ANGPTL2)是血管生成素样家族的成员，是一种脂肪组织衍生的分泌糖蛋白[7]。ANGPTL2的主要功能是血管重塑和组织修复，不过，最近的研究表明过量的ANGPTL2信号介导慢性炎症以及随后的病理不可逆组织重塑，推测其可能在PCOS的发病中起着特殊的作用。本实验中发现，与正常对照组相比，PCOS组大鼠血清胰岛素水平明显升高，卵巢组织中ANGPTL2蛋白表达也明显升高，表明ANGPTL2可能通过影响胰岛素的抵抗性，引起卵巢内及其周围脂质代谢的异常，从而影响 PCOS患者卵泡的正常发育。中药和西药治疗后，各治疗组血清ANGPTL2和胰岛素水平均有不同程度的下降，表明抑制体内ANGPTL2的表达可以改善体内胰岛素的敏感性，意味着ANGPTL2可能是PCOS患者发生胰岛素抵抗的一个重要的脂源性感染介质，与PCOS的病程发展关系密切。Liu Z等学者曾在PCOS患者的CCMⅡ中检测ANGPTL1和ANGPTL2基因的差异性表达，结果只有ANGPTL2显著高表达，说明ANGPTL2可能更能影响PCOS患者颗粒细胞的成熟发育[8]。这与本研究结果相一致。

虽然许多学者认为IR是PCOS发病的关键因素，但IR并不能解释PCOS的所有临床特征。可能IR只是PCOS发病机制的一部分，信号通路改变可能才是PCOS发病机制的关键因素。PI3K-Akt信号通路的改变与胰岛素抵抗(IR)、糖尿病和代谢紊乱密切相关[9]。ANGPTL2可以通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号途径对人的脐静脉内皮细胞发挥抗凋亡作用[10]。但ANGPTL2是否也是通过PI3K/Akt信号途径在PCOS的致病过程中发挥作用，尚未见此类报道。本研究发现与空白对照组相比，模型对照组大鼠卵巢组织中与凋亡相关的Foxol表达明显升高，AKT表达也明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。用二甲双胍和中西医治疗干预后，两者的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，这与ANGPTL2表达相一致。说明ANGPTL2可能通过PI3K-Akt途径影响卵泡生发泡破裂(GVBD)减数分裂过程[11]，过量ANGPTL2可抑制AKT从而限制GVBD，进而影响卵泡发育[12]。由此可以推测ANGPTL2基因与PCOS的致病过程具有一定的相关性。

PCOS发病机制复杂，临床异质性较大，给诊断和治疗带来很多困难。多数患者对长期服用激素类药物心有抵触，且停药后容易复发，故更愿意接受中药治疗。随着中医对PCOS研究的不断深入，认为肾虚血瘀是PCOS的基本病机[13]，多数研究已经证实补肾化瘀方对多囊卵巢综合征病例疗效显著。本实验结果显示：与模型对照组相比，各治疗组均能不同程度改善PCOS大鼠体内IR，并能降低卵巢组织中ANGPTL2水平，在改善IR方面以中西药联合用药最为明显，而在降低卵巢组织中ANGPTL2及相关信号通路方面，则以西药组最明显(P<0.05)。推测补肾化瘀方可能减轻卵巢组织局部因血液瘀滞产生的炎症从而改善胰岛素抵抗达到治疗PCOS的目的。但是该方剂使血流通畅的同时是否又促使了新生血管的产生，从而间接引起ANGPTL2的生成增多，具体机制则需要更深一步的研究。

综上所述，ANGPTL2可能通过PI3K/AKT信号通路，影响凋亡基因表达和胰岛素抵抗，在PCOS的发生发展中起着不可忽视的作用，或许血循环中ANGPTL2水平可成为一种新的监控PCOS病程进展的小分子物质。补肾化瘀方联合二甲双胍可以明显降低PCOS大鼠体内胰岛素水平，但是否促进ANGPTL2的表达尚需要进一步深入研究。