新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白C端重组蛋白的原核表达、纯化及应用

张西西 张怡青 李玉林 韩笑 王国强、4 王晓军 王旭东王云龙

（1.河南师范大学，新乡 453007；2.郑州职业技术学院，郑州 450010；3.河南省生物工程技术研究中心，郑州 450010；4.河南中医药大学，郑州 450046；5.河南省职工医院，郑州 450002）

自2019 年 12 月以来，新型冠状病毒（SARSCoV-2）引发的肺炎疫情在中国武汉暴发，随后疫情迅速蔓延，扩散至全球各地区［1］。在不到两个月的时间里，疫情已经蔓延至超过200个国家和地区，对人类的生命安全和全球经济造成巨大的负面影响［2-3］。面对急速增长的发热疑似病例或无症状的密切接触者，开发出灵敏、快速、特异的诊断检测技术仍是当务之急。

SARS-CoV-2 是一种新型高传染性的冠状病毒，基因大小约为 29.8 kb，基因组 5′端的基因编码主要为部分非结构蛋白。3′端编码 4 种结构蛋白，包括表面刺突糖蛋白（spike，S）、小包膜蛋白（envelope，E）、外膜蛋白（membrane，M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid，N）。N蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白，位于病毒内部，具有高度保守性［4-5］。N蛋白是一种具有高免疫原性的磷酸化蛋白，在病毒体组装过程中，N蛋白与病毒RNA结合形成螺旋核衣壳并且与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。因此，N蛋白常用作冠状病毒检测的靶点，是免疫学快速诊断试剂的核心原料［6］。

然 而，SARS-CoV-2和 SARS-CoV、MERS-CoV的结构蛋白有较高的同源性［7-8］，为提高荧光免疫层析试纸条的特异性，本研究分析了N蛋白全长的保守性，选取全长N蛋白序列中C端，约13 kD的特异序列作为靶蛋白，构建重组质粒，在原核系统中诱导表达SARS-CoV-2 N蛋白C端重组蛋白［9］，利用Ni2+亲和层析柱和凝胶过滤层析柱探索蛋白的纯化方式从而获得高纯度的目的蛋白，初步应用于荧光免疫层析试纸条的包被抗原，可以快速区分PCR确诊的新冠阴阳血清，为COVID-19的快速大规模初期筛查提供生物原料。

1 材料与方法

1.1 材料

抗SARS-CoV-2 全长N蛋白兔抗血清、原核系统表达的SARS-CoV-2 全长N蛋白、大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）、质粒pET21b由本实验室保存；COVID-19核酸阴性血清、阳性血清由河南省疾病预防控制中心提供；氨苄青霉素、IPTG诱导剂为索莱宝公司产品；酵母粉、蛋白胨为OXOID公司产品；氯化钠为国药集团化学试剂有限公司产品。三羟甲基氨基甲烷为河南东格生物技术有限公司产品；咪唑为生工生物工程股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 目的序列的合成和重组载体构建 参考NCBI的SARS-CoV-2冠状病毒的N蛋白全长基因序列（GenBank：MT434817.1），通过 EMBL-EBI数据库进行序列比对，选取N蛋白全长序列C端（249AA-350AA）110个氨基酸对应的基因序列作为靶序列，通过密码子优化，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行人工合成，目的基因序列连入载体pUC57。以pUC57/NC 为模板，NC-F和NC-R为引物（表1），扩增新冠N蛋白C段靶基因序列。扩增片段和质粒pET21b分别通过双酶切（Nde Ⅰ和XhoⅠ）、连接和转化将合成的靶基因序列插入pET21b质粒，构建重组载体，双酶切和测序鉴定正确的重组质粒命名为pET21b-NC。

1.2.2 重组蛋白诱导表达 将pET21b-NC重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞。活化的pET21b-NC的重组菌按1∶1 000的比例加入含有氨苄青霉素（50 μg/mL）LB培养基中摇晃培养至菌液OD600nm至0.8时，设置37℃、25℃、16℃3个不同的诱导温度，按终浓度为0.4 mmol/L加入IPTG，诱导时间分别为4 h、10 h、20 h，之后将菌体离心，用20 mmol/L Tris（pH8.0）缓冲液重悬并超声破碎，离心后收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别制样进行SDS-PAGE电泳分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 重组蛋白发酵和纯化 重组蛋白在37℃，0.4 mmol/L IPTG诱导表达4 h时，80%的目的蛋白以水溶性形式存在。按照此条件，大量诱导表达目的蛋白，诱导结束离心收集菌体，20 mmol/L Tris（pH8.0）缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎（350 W，工作5 s，停止 5 s，超声 20 min），12 000 r/min离心 10 min，将超声破碎后的上清溶液用0.45 μm滤膜过滤，滤液直接上样，进行Ni2+亲和层析纯化，上样流速为3.5 mL/min，上样结束，用缓冲液继续冲洗至基线，换用含有100 mmol/L咪唑的缓冲液除去杂蛋白，冲洗至基线，再用含300 mmol/L咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，收集流出液。流出液经过超滤浓缩管（截留分子量：3 kD）浓缩之后，以2 mL/min速度上样，进凝胶过滤层析（Superdex-200），收集第2个流出峰［10］，即为纯化目的蛋白。使用SDS-PAGE电泳对其进行检测，并用 Image Lab 6.0软件对蛋白纯度进行量化分析，同时用高效分子排阻色谱法鉴定重组蛋白的纯度。

1.2.4 Western blot鉴定重组蛋白 将纯化后的目的蛋白和诱导前的样品进行 SDS-PAGE 电泳，电泳结束，通Bio-Rad湿转电泳仪冰浴条件下进行转膜（100 V，40 min）。转膜后放入 10 mL 含5%脱脂奶粉的PBST溶液中，37℃封闭2 h，弃去封闭液，加入用PBST 1∶1 000稀释的抗全长N蛋白兔抗血清，37℃孵育2 h，弃去一抗，用PBST洗涤3次，每次5 min，然后加入1∶2 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，37℃，孵育2 h，再用PBST洗涤3次，每次5 min；最后滴加DAB显色液进行显色观察。

1.2.5 重组目的蛋白的初步应用 参考前期本实验室荧光免疫层析试纸条制备方法［11-12］，用纯化的新冠重组NC蛋白作为包被抗原，以1 mg/mL在NC膜上划线，实验室制备的全长N蛋白标记荧光微球，组装荧光免疫层析试纸条。以兔抗全长N蛋白兔抗血清作为阳性对照，正常人血清作为阴性对照，优化层析试纸条各种工艺，条件确定后，组装50个试纸条，送往河南省疾病预防控制中心进行检测，共检测20份新冠核酸检测确证的临床血清标本（10份阳性，10份阴性），滴加80 μL的原倍血清至加样孔，10 min后将试纸条置于紫外灯下照射观察，阴阳通过检测线是否出现荧光信号来进行判断。

2 结果

2.1 靶目的蛋白序列选取

通过 EMBL-EBI数据库对 SARS-CoV-2（YP_009724397.2）、SARS-CoV（NP_828858.1）和 MERSCoV（YP_009047211.1）的N蛋白进行氨基酸序列比对，可以看出在N蛋白的C端三者有较大的差异，因此本研究选取了249-350AA共102个氨基酸序列作为靶序列，人工合成构建重组载体，以期原核表达纯化后，N蛋白具有更高的特异性（图1）。

2.2 重组质粒构建及鉴定

以pUC57/NC 为模板，特异型引物NC-F和NC-R进行扩增，得到了大小约为350 bp的靶基因片段，与预期相符（图2-A）。重组载体用Nde I和Xho I双酶切验证，得到目的片段和pET21b线性片段（图2-B），表明成功构建了重组表达质粒pET21b-NC。

2.3 重组蛋白可溶性表达分析

通过设置不同的诱导温度和时间来探索重组蛋白是否能够进行可溶性表达，SDS-PAGE（图3）电泳结果可以看出：在37℃、25℃和16℃诱导条件下，上清和沉淀均有目的蛋白，且上清中目的蛋白的表达量均高于沉淀表达，37℃诱导4 h条件下目的蛋白在上清中表达量最大（泳道 2），因此，诱导条件确定为：在0.4 mmol/L IPTG，37℃诱导4 h。

2.4 重组蛋白的纯化

将工程菌株BL21（DE3）/pET21b-NC按照2.3诱导培养条件进行大量表达，采用Ni2+亲和层析柱和凝胶过滤层析柱纯化目的蛋白，诱导前菌液和诱导后超声破碎上清以及不同方法纯化后用12% SDSPAGE电泳观察分析，结果显示，目的蛋白分子量约为13 kD，与预期相符，其在上清液中大量表达，Ni2+亲和层析柱纯化后，目的蛋白纯度达85%，再经过凝胶过滤层析后，除去了一条杂带，纯度进一步提升，达到90%以上（图4）。进一步通过高效分子排阻色谱法对最终纯化的蛋白样品进行纯度检测，结果显示，重组蛋白在2-3 min左右出现明显单一的色谱峰，其他位置未出现色谱峰，说明重组蛋白有很好的纯度（图5）。

图1 SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV 的 N 蛋白 C 末端氨基酸序列对比Fig.1 Comparison of N protein C-terminal amino acid sequences of SARS-CoV-2, SARS-CoV and MERS-CoV

图2 N 蛋白 C 端序列基因表达载体的 PCR 及双酶切鉴定Fig.2 N protein C-terminal sequence gene expression vector PCR and double enzyme digestion

图3 重组蛋白可溶性表达Fig.3 Soluble expression of recombinant protein

图4 SARS-CoV-2 N 蛋白 C 端重组蛋白原核表达和纯化的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression and purification of the C-terminal recombinant protein of SARS-CoV-2 N protein

图5 SARS-CoV-2 N 蛋白 C 端重组蛋白凝胶过滤层析纯化的高效液相分析Fig.5 High performance liquid phase analysis of SARSCoV-2 N protein C-terminal recombinant protein gel filter chromatography

2.5 Western blot鉴定重组蛋白

Western blot结果显示，在纯化后（泳道1）13 kD处有一条明显的单一条带，而诱导前（泳道2）无条带，表明目的蛋白正确表达，同时纯化的目的蛋白可以与全长的N蛋白免疫兔抗血清进行特异性反应（图6）。

图6 SARS-CoV-2 N 蛋白 C 端重组蛋白免疫印迹分析Fig.6 Western blotting analysis of SARS-CoV-2 N protein C-terminal recombinant protein

2.6 重组蛋白的初步应用

10份新冠阴性血清T线无荧光信号，C线均有荧光信号，10份阳性血清中有9份T线显示强的荧光信号，1份显示弱的荧光信号，C线均有荧光信号（图7）。该结果说明目的蛋白作为包被抗原组装的免疫荧光层析试纸条可以初步应用于新型冠状病毒抗体的初筛。

图7 荧光免疫层析试剂血清检测Fig.7 Serum detection of fluorescent immunomy

3 讨论

在SARS-CoV-2冠状病毒的4种主要的结构蛋白中，N蛋白是冠状病毒重要的结构蛋白，而且是病毒的主要抗原，N蛋白有较强的免疫原性，可诱导机体产生较强的免疫应答［13］。其抗体较抗 S 蛋白抗体出现早，检出率高，维持时间长，说明 N 蛋白的免疫原性高于 S蛋白。但是因与其他冠状病毒序列有较高的同源性［14-15］，特异性不强，为了提高N蛋白的特异性，本研究将N蛋白的基因组进行改造，截取C端具有特异性的序列，人工合成C端序列并制备基因工程菌通过原核表达的方式获得可溶性重组蛋白。

本研究运用原核系统对重组蛋白进行诱导表达，并确定其在诱导温度为37℃，诱导时间为4 h，IPTG终浓度为0.4 mmol/L 时重组蛋白可在上清溶液中大量表达。本研究探索了重组蛋白的纯化方式并确定了运用层析柱的方式纯化蛋白，通过Ni2+亲和层析使蛋白溶液中大多数杂质去除，使重组蛋白的纯度得到大幅提升，又使用凝胶过滤层析，利用其对不同大小分子的分离作用使重组蛋白的纯度进一步提升，通过SDS-PAGE电泳和高效液相可以确定最终得到的重组蛋白纯度可达到90%以上。本研究以全长的N蛋白免疫兔抗血清为一抗，通过Western blot可以证明重组蛋白能够与全长的N蛋白抗体结合，具备良好的可结合性和生物活性。本研究将重组蛋白应用于荧光免疫层析试纸的包被抗原，健康人血清未出现假阳性，10份核酸检测阳性的病人血清可以检测出9份阳性结果和1份弱阳性结果。说明重组蛋白具备一定的抗原性和应用潜力。

由于本研究测试的血清样本量较少，还不足以说明以重组蛋白为原料制作的检测试剂的临床应用效果，以及相较于其他类型检测试剂的特异性的提升。但是，以上结果仍然可以说明本研究制备的重组蛋白具备较高的生物活性和应用潜力，可用于核酸检测全流程质控及试剂盒开发阶段的模拟测试。

4 结论

SARS-CoV-2 N 蛋白 C末端在适当的条件下（诱导温度 37℃，诱导时间 4 h， IPTG 终浓度0.4 mmol/L），可在大肠杆菌表达系统中超过80%以可溶形式表达。通过 Ni2+亲和层析和凝胶过滤层析，目的蛋白纯度超过 90%。且目的蛋白在荧光免疫层析检测试纸中表现出较好的反应原性和特异性，可初步用于 COVID-19 的早期初筛。