拟穴青蟹对饵料中稳定同位素富集效应的初步研究

黄国强，曹素会，刘旭佳，彭银辉，刘永宏，黄亮华，钟声平

（1.广西中医药大学海洋药物研究院，广西 南宁 530200； 2.广西科学院广西北部湾海洋研究中心/广西近海海洋环境科学重点实验室，广西 南宁 530007； 3.北部湾大学海洋学院/广西海洋生物多样性养护重点实验室，广西 钦州 535011）

我国大陆东南沿海分布有锯缘青蟹 (Scylla serrata)、紫螯青蟹 (S.tranquebarica)、拟穴青蟹(S.paramamosain)、榄绿青蟹 (S.olivacea) 4种青蟹，其中拟穴青蟹分布最广且数量最多[1]。青蟹既是我国东南沿海重要的养殖蟹类[2]，也是红树林和河口区域的重要捕食者。红树林生态系统不仅可以为拟穴青蟹提供栖息和庇护场所，红树林内及周边生长的动植物还能为其提供丰富的饵料。已有研究表明，红树林区域野生青蟹的饵料主要由海洋来源的碎屑、贝类、甲壳类、鱼类组成，不同组分的占比在不同地点有明显差异[3]。国内对拟穴青蟹天然饵料来源的报道较少，主要原因可能是青蟹摄食时将食物用大螯抱握或夹碎后，再经过大颚切碎后摄入，大部分饵料的外形结构已经被破坏，因而难以用传统的方法进行鉴定和定量。相比之下，稳定同位素技术由于不需要对难以辨认的饵料碎片进行鉴定分类，被广泛应用于水生生物的饵料组成和营养来源研究[4-8]，进而应用于海洋和淡水生态系统的食物网构建[9-13]和营养级分析[9-10,14-16]，也用于分析水产养殖系统中养殖生物的饵料组成和营养来源[17-20]。

应用稳定同位素技术分析饵料和营养来源，需要一个判别值用于模型计算。一般而言，动物与其食物之间存在较为明确的判别值，碳稳定同位素判别值 (Δ13C) 介于0‰～1‰，氮稳定同位素判别值(Δ15N) 介于 3‰～4‰[21-22]，但不同生物类群或生活环境之间存在较大差异，例如在红树林及近海滩涂，由于其环境独特且复杂，稳定同位素的富集与其他区域可能有较大差别。Yokoyama等[23]对河口大型底栖动物的研究结果表明动物-食物的Δ13C达到2‰～2.2‰。而澳大利亚红树林中的底栖动物稳定碳同位素 (δ13C) 甚至比红树植物还低3‰～4‰[24]。因此，如果要利用稳定同位素研究动物食物来源和营养关系，需要通过更多的室内喂养控制实验来测定动物与其食物之间的稳定同位素判别值[25]。拟穴青蟹对不同饵料的稳定同位素富集效应尚未见报道，因此，本实验采用稳定同位素技术，测定北海近海拟穴青蟹对红树林及邻近滩涂5种近海天然饵料和养殖的双齿围沙蚕 (Perinereis aibuhitensis)的富集效应，获得拟穴青蟹与不同生物饵料的稳定同位素判别值，为开展青蟹在红树林近海的食物链与营养来源分析提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验设施

实验采用60个透明塑料整理箱 (长、宽和高分别为50、40和40 cm)，在室内车间将养殖青蟹、经过消毒的塑料整理箱用淡水清洗后加入1/3深度的沙滤海水，每个养殖箱配置1个气石保持微量充气。

1.2 实验用水

实验用水是经过砂滤和紫外线消毒的育苗用海水，盐度26～30，pH 7.9～8.3，持续充气保持溶解氧质量浓度＞5.0 mg·L−1。

1.3 蟹苗来源

实验以广西壮族自治区海洋研究所繁育的2期拟穴青蟹仔蟹为材料，挑选健康仔蟹200只，用容量为2 L的塑料桶，底部铺沙1 cm，经单独隔离用对虾饲料投喂30 d，体质量达到0.5～1.2 g后作为实验用蟹苗。

1.4 饵料

实验采用犬牙珠鰕虎鱼 (Acentrogobius caninus)、李氏䲗 (Callionymus richardsoni)、须赤虾 (Metapenaeopsis barbata)、杂色蛤 (Ruditapes philippinarum)、多齿围沙蚕 (P.nuntia) 和双齿围沙蚕作为饵料，这6种饵料除了双齿围沙蚕为养殖种类外，其余为北部湾近海分布的底栖性海洋生物，均是拟穴青蟹潜在的饵料来源。选择养殖的双齿围沙蚕作为实验饵料，是由于其稳定同位素含量可能与天然饵料差别较大，对青蟹稳定同位素富集可能产生影响。所有饵料在实验开始前从沿海同一地点收集足够实验期间使用的数量，用经砂滤的海水养殖24 h后，根据每天投喂量分袋分装后冷冻保存待用。

1.5 实验设计

实验用60个塑料整理箱进行，采用完全随机排列方式分配至6种饵料处理，每种饵料分别用10 个整理箱作为10个重复，每个箱养殖青蟹1只。

1.6 青蟹放养与采样

养殖箱准备安排完成后，从培育的200只蟹苗中随机抽取60只，称体质量后放入养殖箱，并做好相关数据记录。剩余的青蟹按每袋15只随机抽取6袋作为初始样品。

1.7 日常管理

青蟹每天投喂1次。把饵料从冰箱取出，自然解冻后，鱼类去除头部和骨骼的整个躯体肌肉作为饵料，虾类饵料取去除头部和外壳的整个躯体肌肉作为饵料，贝类去壳后的整个软体部作为饵料，沙蚕取整条作为饵料，根据青蟹每天摄食量将饵料剪成适当的小块，称质量后投喂。每天投饵前将拟穴青蟹残饵从水中捞出。隔天换水1次，每次换水100%。海水在室内水泥池储存，以保持与养殖箱温度基本一致。

1.8 样品处理与测定

66 d实验养殖期结束后，青蟹经24 h停食，用纱布吸干表面水分，称体质量并记录数据。然后每只青蟹作为一个结束样品。青蟹初始样品和所有结束样品在烘箱中以70 ℃烘干至恒质量，然后用粉碎机粉碎，将粉碎后的样品过100目筛后，再用浓盐酸熏蒸除去无机碳。鱼类饵料以去除头部和骨骼的整个躯体肌肉作为样品，每份样品取15尾，每种鱼取6份样品；虾类饵料取去除头部和外壳的整个躯体肌肉作为样品，每份样品为30尾，共取6份样品；贝类饵料取去壳后的整个软体部作为样品，每份样品取30只，共取6份样品；沙蚕取整条作为样品，每份由样品30条沙蚕混合，每种沙蚕取6份样品。饵料样品与青蟹样品的烘干、粉碎、过筛和盐酸熏蒸处理方法一致。处理好的样品送中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所用稳定同位素质谱仪 (Isoprime-100同位素质谱仪) 测定碳和氮稳定同位素含量。

粒粒戴着大围巾和帽子，穿了双排扣收腰大衣，举着相机不停地拍，拍树，拍行人，连电线杆子都拍了，拍着拍着，一个黑色的身影闪进镜头里，用一双眼睛盯住粒粒的镜头。粒粒吓了一跳，急忙移开相机，抬起头。

1.9 数据计算与分析

青蟹成活率 (Survival rate, SR, %)和体质量增长率 (Weight gain rate, WGR, %) 计算公式为：

式中IW和FW分别为实验开始和实验结束时青蟹体质量 (g)。

青蟹对不同饵料中稳定碳和氮同位素的富集效应计算公式为：

式中δ13C和δ15N为样品中稳定碳和氮同位素的比值 (‰)。

数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析。因本文计算的成活率、生长率和特定生长率均为百分数且变动范围较大，故进行反正弦转换后再进行方差分析。

2 结果

2.1 体质量、成活率和体质量增长率

2.2 不同饵料的δ13C和δ15N

实验中使用的6种饵料δ13C和δ15N都存在显著差异。6种饵料的δ15N介于7.78‰～15.38‰，其中鱼类和多齿围沙蚕的δ15N显著高于其他饵料，杂色蛤和双齿围沙蚕的δ15N较低 (图2-a)。6种饵料的δ13C介于−22.90‰～−14.96‰，其中杂色蛤和双齿围沙蚕的δ13C较低，李氏䲗和须赤虾的δ13C较高 (图2-b)。

图1 投喂不同饵料的青蟹的初始体质量、结束体质量、成活率和体质量增长率方柱上不同字母表示差异显著 (P＜0.05)，后图同此Figure 1 Initial mass, final mass, survival rate and weight gain rate of S.paramamosain fed with different diets Different lowercase letters on the columns indicate significant difference (P＜0.05).The same case in the following figures.

图2 不同饵料的稳定碳和氮同位素Figure 2 δ13C and δ15N of different diets

2.3 摄食不同饵料青蟹的δ13C和δ15N

实验开始时青蟹的δ13C和δ15N分别为−21.13‰和5.24‰。实验结束时摄食不同饵料的青蟹体内δ13C和δ15N也出现显著差异，δ15N有较大幅度的提高 (图3-a)，δ13C也有不同幅度的增加 (图3-b)。摄食李氏䲗、须赤虾和多齿围沙蚕的青蟹δ13C最高 (图3-b)，摄食李氏䲗和须赤虾的青蟹δ15N最高(图3-a)。

图3 初始和摄食不同饵料青蟹的稳定碳和氮同位素Figure 3 δ13C和δ15N of initial S.paramamosain and S.paramamosain fed with different diets

实验结束时青蟹的δ13C与初始相比有显著提高，但摄食杂色蛤和双齿围沙蚕的提高幅度显著低于摄食其余4种饵料的青蟹。摄食不同饵料的青蟹体内δ15N较初始时也有大幅度提高，其中摄食杂色蛤和双齿围沙蚕的升幅较小 (图4)。

图4 实验结束时青蟹稳定碳和氮同位素含量与初始青蟹的差值Figure 4 Difference of δ13C和 δ15 N of S.paramamosain at end and beginning of experiment

2.4 青蟹对饵料中δ15N和δ13C的富集效应

青蟹对所摄饵料的δ15N和δ13C表现出不同的富集效应。摄食6种饵料的青蟹Δ13C分别为0.7、−0.19、0.22、2.58、−0.12、2.75，Δ15N 介于−2.98～0.21 (图5)。其中摄食犬牙珠鰕虎鱼、李氏䲗和多齿围沙蚕的青蟹对δ15N表现出明显的负富集效应，摄食杂色蛤和双齿围沙蚕的青蟹对δ15N表现出小幅度的富集效应；摄食杂色蛤和双齿围沙蚕的青蟹对δ13C的富集幅度较大，摄食其余4种饵料的富集效应较小或表现为小幅度的负富集。

图5 青蟹对不同饵料中稳定碳和氮同位素的富集效应Figure 5 Enrichment of δ13C和 δ15 N in S.paramamosain fed with different diets

2.5 Δ15N和Δ13C与体质量增长率的关系

对本实验获得的稳定同位素富集效应与体质量增长率的关系进行相关性分析，未发现δ13C的富集效应与体质量增长率有明显关系，但δ15N的富集效应与体质量增长率有显著相关性，其关系可用对数函数Δ15N=3.496 6 ln(WGR)−17.934 (R2=0.857)来描述 (图6)，表明实验期间δ15N的富集效应随着体质量增长率的增加呈非线性的增长。

图6 氮稳定同位素的富集效应与体质量增长率的关系Figure 6 Regression relation between Δ15N and weight gain rate of S.paramamosain

3 讨论

3.1 养殖效果

本实验提供的6种近海滩涂天然饵料中，杂色蛤、双齿围沙蚕和须赤虾对青蟹的养殖效果较好，体质量增长率明显高于2种鱼类，表明双壳类、多毛类和小型甲壳类更符合拟穴青蟹的营养需求。有研究表明，红树林区域野生青蟹的饵料中甲壳类、贝类、多毛类占比居前三位[3]。青蟹的这种生长表现表明这几类饵料能够较好地满足其营养需求，这可能是天然环境中青蟹以双壳类、甲壳类和多毛类为主要饵料的原因之一。

3.2 稳定同位素的富集效应

红树林及近海滩涂是多种底栖鱼类、甲壳类、贝类、多毛类等小型动物的栖息场所，可为青蟹提供丰富的饵料。近年，国内学者也尝试研究拟穴青蟹的稳定同位素特征，并据此为分析红树林与拟穴青蟹间的相互作用提供参考。Wang 等[26]通过分析红树叶和青蟹体内的δ13C，发现海南岛的红树林为拟穴青蟹提供了重要的营养来源。由于青蟹养殖过程中投喂的饵料种类较单一，而野生青蟹的饵料种类多样，这可能导致养殖青蟹的碳、氮稳定同位素组成与野生青蟹有明显的差异[27]，因此可以通过分析青蟹的碳、氮稳定同位素组成来鉴别野生青蟹和养殖青蟹。

国外学者通过测定红树林中3种拟相手蟹(Parasesarma erythrodactyla、Paragrapsus laevis、Helograpsus haswellianus) 的稳定碳和氮同位素比率发现，这3种蟹的碳和氮主要来源不是红树林初级生产力[23]，而其他的研究发现红树林的初级生产力能够为其中生活的蟹类提供较多的碳和氮营养来源[28-29]，不同研究所得结论不一致，可能是由不同区域红树林生态系统存在较大差别所致，也可能与不同研究采用的判别值是根据文献报道的数值而不是实验实测值有关。

在应用稳定同位素技术研究食物链和食物网时，动物与其食物之间的判别值Δ13C介于0‰～1‰，Δ15N介于3‰～4‰[20-21]，也有学者认为捕食者对食物的碳、氮稳定同位素富集效应分别为：Δ13C 为 1‰～2‰，Δ15N 为 2‰～3‰[30-31]。但对河口动物而言，Δ13C超过2‰甚至比河口红树植物低也有报道[22-23]，如Yokoyama等[23]对河口大型底栖动物的研究结果表明动物-食物的Δ13C介于2‰～2.2‰，而相手蟹 (Episesarma singaporense和E.versicolor) 对红树植物叶子的Δ13C甚至可以达到5.1‰和4.1‰[29]。本实验结束时拟穴青蟹体内δ13C和δ15N含量相比人工饲料投喂的初始青蟹有大幅提高，但从对δ13C的富集效应看，摄食李氏䲗和多齿围沙蚕的青蟹Δ13C为负数，摄食杂色蛤和双齿围沙蚕的青蟹Δ13C明显高于2‰，仅摄食犬牙珠鰕虎鱼和须赤虾的青蟹Δ13C介于0‰～1‰。青蟹对15N的Δ15N则与2‰～3‰的差距更大，大多数种类的富集效应为负数。导致这一现象的主要原因可能是由于本实验在冬季进行，温度较低，青蟹生长较慢，体质量增长率不高，体内碳和氮尚未能从饵料中得到完全更新，尽管青蟹δ13C和δ15N有大幅度增加，但与饵料相比，其富集效应未能得到与以往经验数据一致的结果。本实验中摄食杂色蛤和双齿围沙蚕的青蟹对δ13C的富集效应明显大于2‰，而摄食其余饵料的青蟹对δ13C的富集效应很小或为负数，表明栖息于潮间带和浅海的拟穴青蟹与其他河口动物相似，对稳定同位素的富集表现有较大的变动范围。2种相手蟹摄食红树叶后，δ15N含量随喂养时间延长表现出较为稳定的上升趋势，但δ13C则无这种趋势[29]。本实验发现了类似的现象，Δ15N与青蟹体质量增长率表现出明显的对数函数关系，未发现Δ13C与体质量增长率之间存在明显相关性。日本和美虾 (Nihonotrypaea japonica)、四角蛤蜊 (Mactra veneriformis)、菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 的δ15N和δ13C含量随着体质量增长率的升高，以幂函数方式朝饵料的稳定同位素含量接近，但达到一定水平后升降趋于平缓[22]。稳定同位素的富集效应在不同研究中表现出较大差异，这可能与河口和滩涂生物适应多变的环境有关。

本文为评估红树林及邻近滩涂栖息的小型动物对拟穴青蟹的营养贡献进行了实验，发现青蟹对不同饵料的稳定同位素具有富集效应，但要获得可用于红树林及近海滩涂食物网和食物链研究的稳定同位素富集参数，还需要根据拟穴青蟹的生态习性和近海滩涂环境条件进一步优化实验条件，开展更多的实验研究。