秋茄叶片愈伤组织褐变研究

池上评

摘要 [目的]建立红树秋茄的愈伤组织体系，为实现秋茄种质资源离体保存及其多样性研究提供科学依据。[方法]以红树林秋茄幼嫩叶片作为外植体，研究2，4-D和6-BA不同浓度配比下秋茄叶片愈伤组织的诱导率，以及不同激素水平对秋茄叶片和愈伤组织褐变情况的影响。[结果]2，4-D对秋茄叶片愈伤组织形成是必需的，添加一定量的6-BA有助于提高愈伤组织诱导率，最佳激素配比为MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，诱导率最高，达35.0%;秋茄叶片和愈伤组织均有褐变现象发生，21 d内，褐变率达33.3%～45.0%。[结论]初步明确了秋茄叶片愈伤组织的诱导条件及褐变影响因素。

关键词 秋茄;愈伤组织;继代培养;褐变

中图分类号 S792.99 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）09-0130-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.033

Abstract [Objective] To establish the callus system of Kandelia candel and provide scientific basis for in vitro conservation and diversity research of Kandelia candel germplasm resources. [Method] Taking young leaves of Kandelia candel as explants， the callus induction rate of Kandelia candel leaves under different concentrations of 2，4-D and 6-BA， and the effects of different hormone levels on the browning situation of Kandelia candel leaves and callus were studied. [Result] 2，4-D was necessary for callus formation of Kandelia candel leaves. Adding a certain amount of 6-BA was helpful to improve the callus induction rate. The best hormone ratio was MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA， and the induction rate was up to 35.0%. The leaves and callus of Kandelia candel had browning phenomenon， and the browning rate reached 33.3% - 45.0% within 21 days. [Conclusion] The callus induction conditions and browning influencing factors of Kandelia candel leaves were preliminarily determined.

Key words Kandelia candel;Callus;Subculture;Browning

红树林是我国东南沿海的木本植物群落，对调节全球的气候变化具有重要意义[1-2]，又因其有着丰富的生物量而具有巨大的生态价值[3-4]。同时，完整的红树林不仅可以为人类提供良好的游憩场所，还是一个药源宝库，因此具有很高的社会价值和经济价值[5-6]。秋茄（Kandelia candel）是红树林的主要造林树种[6]，具有重要的生态保护价值。目前，秋茄的自然分布北界位于福建北部（27°20′N），浙江温州有少量人工栽培[7-9]。秋茄一般采用胚轴（胎生苗）直接插植进行繁殖，不仅繁殖方式单一，还存在繁殖周期较长、效率低、可控性差、人工移植成活率低、成本高及不易大面积推广等问题。随着组织培养技术在林业上的应用[10]，研究如何利用这一技术来解决秋茄扩大繁殖具有重要意义。目前，关于秋茄组织培养的报道较少，黄有军[11]以秋茄顶芽和幼叶为外植体研究了光照和黑暗条件下，不同激素配比对愈伤组织形成的影响，结果表明，外源生长素对秋茄的幼叶愈伤组织形成是必需的，1 mg/L 2，4-D 或≥4 mg/L NAA 对愈伤组织形成有较好作用。笔者通过建立红树秋茄的愈伤组织体系，研究最佳诱导激素配比及褐变影响因素，旨在为深入保护和开拓红树林植物种质资源的遗传多样性以及保护红树林资源、促进红树林生态环境的良性循环提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以福建省晋江坫头国有防护林场红树植物秋茄幼叶作为外植体进行组织培养。

1.2 方法

1.2.1 秋茄愈伤组织形成。

挑选新鲜外植体，取嫩叶，在洗洁精溶液中浸泡5 min，自来水冲洗2 h，在无菌条件下将外植体置于75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗1次;然后用0.2%HgCl2溶液消毒8 min，无菌水漂洗4～5次，切取约9 cm2叶块接种在不同激素配比的培养基上进行愈伤组织诱导。定期观察叶片愈伤组织的诱导与生长情况。

1.2.2 不同激素配比对秋茄愈伤组织形成的影响。

以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的外源生长素2，4-D、细胞分裂素6-BA进行激素配比完全试验（表1），其中，pH为5.8，于25 ℃完全黑暗條件下培养。每处理接种20瓶。培养20、30、40 d后，观察记录愈伤形成情况，并记录叶片诱导数，计算诱导率。

诱导率=诱导出愈伤组织的瓶数/接种数×100%

1.2.3 不同激素水平下秋茄叶片褐变现象观察。

用秋茄叶片进行愈伤组织诱导试验，选取其中1组作为秋茄叶片褐变现象观察材料，并定期观察秋茄叶片的褐变现象，4种不同激素配比为

A1：MS+0.5 mg/L 2，4-D+0 mg/L 6-BA;

A2：MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA;

A3：MS+0.5 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA;

A4：MS+0.5 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA。

1.2.4 不同激素水平下秋茄愈伤组织褐变现象观察。

不同激素水平下，对已经继代4次的秋茄愈伤组织进行植物器官组织诱导，定期观察愈伤组织褐变现象。每处理接15瓶，每瓶接2～3个愈伤团，培养基设置为

B1：MS+2.0 mg/L 2，4-D+0 mg/L 6-BA;

B2：MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA;

B3：MS+2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA;

B4：MS+2.0 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA。

1.3 培养条件

温度为（25±2） ℃，相对湿度保持在70%～80%，光强为1 000～1 500 lx，光照12 h/d。

1.4 数据统计

采用Excel软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 秋茄愈伤组织形成情况

经观察，接种20 d 后在切口处可见少量愈伤组织，呈淡绿色;30 d 左右愈伤组织逐渐明显，形态松散，呈淡黄色;40 d左右愈伤组织呈淡黄色，且不再扩大;约60 d呈黄褐色。

2.2 不同激素配比对秋茄愈伤组织形成的影响

由表1可知，2，4-D能诱导秋茄愈伤组织的形成，添加6-BA 后，诱导率有一定程度的提高，且随着2，4-D浓度的升高，诱导率呈先升高后下降趋势，当2，4-D浓度为1.0 mg/L时，诱导率最高，而2，4-D浓度为2.0 mg/L时，诱导率反而下降。综合来看，以处理B11（MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA）的诱导率最高，达35.0%，其次为处理⑩，诱导率为25.0%。

2.3 不同激素水平下秋茄叶片褐变情况

在不同激素水平条件下，诱导秋茄叶片愈伤组织过程中，叶片褐变先从外植体的切口开始，并逐渐向外植体中心部位蔓延，最后外植体呈腐熟状。由表2可知，4种处理方法均引起秋茄叶片的褐变，在外植体移入培养皿初期，秋茄叶片褐变速率较快，随后逐渐减慢。秋茄叶片的褐变率都相对较高，在第21天，A1和处理A3达到40%，A2和A4达到45%。

经方差分析可知，不同处理对秋茄叶片的褐变作用差异显著（P<0.05），不同培养时间对秋茄叶片的褐变作用差异极显著（P<0.01）。

2.4 不同激素水平下秋茄愈伤组织褐变情况

从图1可见，在不同激素水平条件下，诱导秋茄愈伤组织形成器官的过程中，秋茄愈伤组织与培养基接触部分先出现褐变，并向其他部位蔓延，直至整团愈伤组织全部褐变。

由表3可知，4种处理均会引起秋茄愈伤组织的褐变，在愈伤组织移入培养皿初期，褐变速率较快，而后逐渐减慢，愈伤组织的褐变率都相对较高，在第21天，B1、B2和B3均达到40.0%，B4达到33.3%。经方差分析，不同激素浓度处理对秋茄愈伤组织的褐变作用差异显著（P<0.05），不同培养时间对秋茄愈伤组织的褐变作用差异极显著（P<0.01）。

3 结论与讨论

3.1 秋茄愈伤组织形成条件

该试验表明，幼叶可以作为红树秋茄组织培养的外植体，同时，在挑选外植体材料时尽量选取叶片幼嫩部位，且无机械损伤，防止消毒剂伤害外植体细胞，导致其在诱导愈伤过程中发生褐变。

3.2 外源物质对秋茄愈伤组织形成的影响

该研究结果表明，外源生长素对秋茄幼叶愈伤组织的形成是必需的，这与马丽等[12]的研究结果一致。笔者通过筛选，得到叶片愈伤组织的诱导最佳激素配比为MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，即当2，4-D 浓度在1.0 mg/L 时有较高的愈伤组织诱导率，添加一定量的6-BA 有助于提高愈伤组织诱导率，但过高的6-BA 则抑制愈伤组织的发生。据报道[13-15]，外源物质活性炭在组培技术上具有广泛的应用，特别是用活性炭来预防外植体褐变的发生具有重要作用[16]，这有待于今后进行进一步研究。

3.3 秋茄组织培养过程中叶片和愈伤组织褐变原因

该试验结果表明，在秋茄叶片愈伤的诱导和愈伤组织继代的过程中均会发生褐变，且褐变率均较大。总体来看，褐变是阻碍秋茄组织培养技术发展的一大难题。该研究表明，选用较嫩部位进行培养可有效减少褐变的发生，选取秋茄次生物质含量较少的部位也可有效降低褐变率。有研究表明，在进行愈伤组织诱导器官试验时，使用继代次数较低的愈伤组织可降低褐变的发生。

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