金枪鱼骨胶原肽对葡聚糖硫酸钠诱导急性结肠炎小鼠的预防效果

舒聪涵，相兴伟，孙继鹏，王家星，廖妙飞，邓尚贵，周宇芳,，郑 斌,

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316021；2.浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316021；3.浙江工业大学，浙江杭州 310000）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种反复发作的非特异性肠道炎症性疾病。溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病的一种，其病变部位以直肠和乙状结肠为主，在结肠黏膜及黏膜下层形成炎症性病变。该病病程漫长常反复发作，临床表现为间歇性腹泻带血、里急后重等[1]。该病过去常见于西方发达国家，近年来亚洲地区发病率也出现上升趋势[2]。在我国就有1.2 亿人群患有肠胃疾病，消化性溃疡发病率达10%以上[3]，然而，其根本的病因及发病机制尚不清楚，目前考虑是遗传、免疫、肠道菌群和环境等多因素综合作用的结果[4]。现在常用的治疗药物包括抗炎药、氨基水杨酸盐、抗腹泻药、皮质类固醇、抗生素、免疫调节剂、生物制剂等[5-6]，但这些药物在发挥药效的同时还会产生严重的副作用，长期服用会导致机体免疫力下降，更容易感染疾病，对健康产生不利影响。因此，非常有必要寻找并开发安全有效、无副作用的新型活性物质，为结肠炎的防治提供新策略。

胶原蛋白是肠黏膜细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的主要结构蛋白。病理生理学上认为UC 患者黏膜和黏膜下区域的溃疡是由于ECM 过度降解所导致[7]。胶原蛋白和胶原蛋白水解物都被证明是治疗外伤性溃疡的良好基质[8]。据报道，河豚Ⅰ型胶原蛋白可以有效抑制由2，4，6-三硝基苯磺酸诱发的小鼠结肠炎症状，抑制结肠细胞凋亡和过氧化损伤[9]。王志聪等[10]发现鳕鱼皮胶原肽能够通过增强大鼠胃黏膜屏障及机体抗自由基氧化水平，产生对急性胃黏膜损伤的保护作用。Azuma 等[11]研究表明鱼鳞胶原蛋白肽在DSS 诱导的急性溃疡性结肠炎模型中发挥了抗炎作用。

骨胶原肽是骨胶原蛋白的水解产物，其抗炎[12]、抗氧化[13-14]、降血压[15-16]、抑菌[17]等生物活性被相继报道。金枪鱼作为一种深海鱼类，素来以营养价值高、纯天然、无污染等优点享誉国际市场，深受消费者欢迎。在金枪鱼加工过程中会产生大量副产物，其中鱼骨约占副产物总量的20%～30%，没有得到很好的开发利用。有研究指出，金枪鱼骨中蛋白质含量为57.2%[18]，可以作为胶原蛋白提取的良好原料。谭洪亮等[19]从金枪鱼骨中酶解和分离纯化得到具有抗氧化活性的胶原肽，可以用于抗氧化相关的功能食品、药物或者食品添加剂；Lee 等[20]研究发现金枪鱼骨中分离得到的骨胶原肽对自发性高血压大鼠有降压作用，可以应用于抗高血压保健品和药物中；Ding 等[21]研究发现金枪鱼骨胶原水解物能显著促进MC3T3-E1 细胞的增殖和分化，具有成骨作用。但是，对于金枪鱼骨胶原肽是否具有预防结肠炎的效果尚未见报道。因此本实验以金枪鱼鱼骨为原料制备骨胶原肽，研究骨胶原肽对DSS 诱导急性溃疡性结肠炎小鼠的预防作用，为开发预防和改善溃疡性结肠炎的功能性产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

健康SPF 级雄性ICR 小鼠 24 只，4 周龄，体重（20±1）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号SCXK（沪）2017-0005；小鼠标准粮 苏州双狮实验动物饲料科技有限公司；葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）美国MPBIO 公司；二胺氧化酶（DAO）试剂盒 森贝伽生物科技有限公司；内毒素（LPS）试剂盒 武汉华美生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒 南京建成生物工程研究所。

HH-S4 数显恒温水浴锅 金坛市亿能实验仪器厂；Synergy H1 酶标仪 美国BioTek；TGL-16M 高速冷冻离心机 上海如湘仪器有限公司；BSA224S 分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Leica 倒置荧光显微镜 德国Leica Microsystems。

1.2 实验方法

1.2.1 金枪鱼骨胶原肽的制备 参照甄守艳等[22]的方法加以修改确定骨胶原肽的制备工艺流程。首先将金枪鱼鱼骨经过胃蛋白酶酶解3 h，接着120 ℃高温高压蒸煮30 min，再添加2%的食用小苏打碱处理2 h，经过干燥等步骤后粉碎过筛得到鱼骨粉。用动物蛋白酶酶解鱼骨粉制备骨胶原肽，主要操作步骤是鱼骨粉质量浓度调整为0.1 g/mL，加入2%的动物蛋白酶，水解温度为50 ℃，酶解8 h，95 ℃灭酶10 min，终止酶解反应。以6000 r/min 离心15 min，弃沉淀，得到酶解液。根据实验室前期研究成果，将骨胶原肽酶解液分别过截留量为1000 和250 Da 的卷式膜，收集250～1000 Da 的分子质量范围的骨胶原肽冻干备用。

1.2.2 动物实验 ICR 小鼠自由采食饮水，适应性饲养7 d 后，按体重随机分为3 组，分别为正常组，造模组和骨胶原肽组，每组各8 只。整个实验周期为23 d，正常组小鼠在整个实验周期中每日灌胃生理盐水，并自由饮用蒸馏水；造模组小鼠在整个实验周期中每日灌胃生理盐水，前14 d 自由饮用蒸馏水，从第15 d开始饮水更换为含有3.5% DSS 溶液持续8 d；骨胶原肽组小鼠前14 d 自由饮用蒸馏水，从第15 d 开始饮水更换为含有3.5% DSS 溶液连续8 d，整个实验周期中每日灌胃0.3 g/kg 的骨胶原肽，剂量设置依据王志聪等[10]的研究成果。饲养条件：室温（22±2 ℃）；湿度60%～70%；日光灯采光，光暗周期12/12 h（光照时间为8：00～20：00）。本实验研究获得浙江海洋大学实验动物伦理委员会批准（编号：2019003）。

1.2.3 体重记录及DAI 评分 每天记录小鼠体重，造模开始每天记录大便的性状，并收集以用来测试小鼠隐血的状况，之后依据以下评分标准（表1）进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分。

表1 DAI 评分标准Table 1 DAI scoring standard

1.2.4 样本收集 造模第8 d，各组小鼠禁食24 h（不禁水）。第8 d 结束后，对各组小鼠进行眼球取血，收集血清。随后颈椎脱臼法处死，收集小鼠胸腺、脾脏、肝脏、心脏、肾脏和结肠等样本。

1.2.5 脏器指数测定 取肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺，用PBS 缓冲液漂洗干净后用滤纸吸干水分，称重，计算各脏器指数。

1.2.6 结肠长度测量及HE 染色 小鼠处死后取全段结肠，测量并记录自然长度，并比较各组小鼠结肠长度的变化。取1 cm 病变结肠组织固定于10%多聚甲醛溶液，然后依次经过修块、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等程序制备石蜡切片，置于伊红染液中染色，中性树胶封片后在显微镜下观察。

1.2.7 ELISA 测定血清中LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力 末次灌胃后对所有小鼠进行眼球取血，在4 ℃冰箱内过夜凝血。次日取出后，2000 r/min离心10 min（4 ℃）；取上清于干净的离心管中，于-80 ℃保存，直到待测时取出。使用试剂盒检测血清中LPS、DAO 含量以及SOD、GSH-Px 活力。

1.2.8 ELISA 测定结肠组织中LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力 取一段结肠约1 cm，按1:9 质量体积比加入生理盐水，用匀浆机对组织进行研磨，然后置于冷冻离心机中3000 r/min 离心10 min（4 ℃）。吸取上清液到离心管中，即为10%的结肠组织匀浆液。使用试剂盒检测结肠组织匀浆液中LPS、DAO含量以及SOD、GSH-Px 活力。

1.3 数据处理

每个实验均重复三次，实验结果采用平均数±标准差的方式表示，应用统计分析软件Graphpad Prism 7.0 进行数据分析。采用One-way-ANOVA 方法进行多组比较，结果判定标准为：P＜0.05 表示差异显著；P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重及DAI 变化情况

小鼠体重变化百分比情况如图1 所示，以初始体重为标准，造模前各组小鼠体重变化总体呈上升趋势。第15 d，除正常组外，其余小鼠均饮用3.5%的DSS 溶液开始造模。造模开始后，正常组小鼠体重仍保持上升趋势；造模组和骨胶原肽组体重变化波动不稳定，造模第4 d，体重开始明显下降。骨胶原肽组与造模组相比，虽然小鼠体重也呈现下降趋势，但体重下降幅度小于造模组。

图1 各组小鼠体重变化（n=8）Fig.1 Body weight of mice in each group (n=8)

疾病活动指数DAI 反映了小鼠体重变化、粪便松散程度以及粪便的出血情况。DAI 评分越高，说明结肠病变越严重。如图2 所示，正常组体重持续增长，大便硬度适中，椭圆状，无稀便及粘液血便，DAI 评分在0 左右。造模结束后造模组小鼠均表现出结肠炎症状，肉眼可见血便或稀便，同时伴随体重下降、饮食饮水量减少、活动减少、毛色变差等，故其DAI 评分显著升高，这表明小鼠结肠炎模型造模成功。骨胶原肽灌胃作用于结肠炎小鼠后，粪便逐渐成型，少有稀便，小鼠生理状况得到了一定的改善，因此骨胶原肽组DAI 评分相对低于造模组。

图2 各组小鼠结肠炎的DAI 评分（n=8）Fig.2 DAI score of mice in each group（n=8）

2.2 骨胶原肽对DSS 结肠炎小鼠脏器指数的影响

由表2 的统计数据可知，造模组小鼠的肝脏指数和脾脏指数显著升高，胸腺指数则明显降低，与正常组相比有显著性差异（P＜0.05）。与造模组相比，骨胶原肽灌胃能显著抑制肝脾指数升高（P＜0.05），显著抑制胸腺指数降低（P＜0.05）。肾脏和心脏指数各组之间均没有显著性差异（P＞0.05）。DSS 会造成肝脾肿大，可能是由于感染或免疫系统的活化从而导致肝脾重量增加。肝脾增加的重量越多，说明肠道炎症越严重[23]。因此，随着症状加重，机体免疫能力全面下降，使得胸腺器官萎缩而重量降低。

表2 各组小鼠脏器指数变化表（n=8）Table 2 Changes of organ index of mice in each group（n=8）

2.3 骨胶原肽对DSS 结肠炎小鼠结肠长度的影响

小鼠结肠作为小鼠肠道的重要组成部分，参与吸收物质供给自身营养，为机体的行动提供能量。如图3 所示，正常组的小鼠结肠呈淡粉色，粪便呈完整颗粒状。在DSS 作用下，造模组小鼠结肠呈暗红色，粪便不成形，有臭味，充血、水肿现象严重，结肠长度同正常组比较明显缩短（P＜0.05）。经过骨胶原肽灌胃后，上述情况得到减轻，结肠长度相比造模组有所增长（P＜0.05），但与正常组的小鼠结肠相比，仍具有显著性差异（P＜0.05）。

图3 各组小鼠结肠长度变化Fig.3 Colon length changes of mice in each group

2.4 骨胶原肽对DSS 结肠炎小鼠结肠组织病理变化的影响

各组小鼠结肠组织病理切片HE 染色经放大200 倍后的观察结果见图4。可以看出，正常组小鼠结肠组织结构清晰，肠绒毛正常，隐窝及腺体结构完整，含有丰富的杯状细胞，黏膜层完整，未见明显炎细胞浸润；造模组小鼠结肠组织结构紊乱，肠腺与隐窝破坏严重，杯状细胞缺失，黏膜层及黏膜下层有大量炎细胞浸润；与造模组相比，骨胶原肽灌胃后小鼠结肠组织结构较完整，腺体排列较整齐，保留了大量的杯状细胞，出现可见的隐窝结构，炎细胞浸润明显减少，改善效果较为明显。

图4 各组小鼠结肠病理组织切片（200×）Fig.4 Pathological sections of colon of mice in each group (200×)

2.5 骨胶原肽对DSS 结肠炎小鼠血清中LPS、DAO含量和SOD、GSH-Px 活力的影响

如图5 所示，相较于正常组，造模组小鼠血清中LPS 含量、DAO 含量极显著上升（P＜0.01）；骨胶原肽组小鼠与造模组相比，极显著地降低了LPS 和DAO 的含量（P＜0.01），这表明骨胶原肽能够有效恢复肠道黏膜屏障损伤。进一步对血清中的SOD、GSH-Px 活力进行检测，发现造模组小鼠的SOD 和GSH-Px 活力均降低，与正常组相比有极显著性差异（P＜0.01）。与造模组相比较，骨胶原肽灌胃后小鼠的SOD 和GSH-Px 活力则极显著地提高（P＜0.01），这表明骨胶原肽在结肠炎中起到一定的抗氧化效果。

图5 骨胶原肽对结肠炎小鼠血清LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力的影响Fig.5 Effects of TBCP on serum LPS,DAO contents and SOD,GSH-Px activity in colitis mice

2.6 骨胶原肽对DSS 结肠炎小鼠结肠组织LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力的影响

检测结肠组织中的LPS、DAO 含量，可以发现与正常组相比，造模组小鼠结肠组织的LPS 含量极显著升高（P＜0.01），DAO 含量显著升高（P＜0.05）；与造模组相比，骨胶原肽组小鼠的LPS 和DAO 含量极显著降低（P＜0.01），结果见图6，这表明骨胶原肽对DSS 诱导结肠炎的肠道黏膜屏障损伤恢复有效。另外，与正常组比，造模组小鼠的SOD 及GSHPx 活力显著下降（P＜0.05）；与造模组相比，骨胶原肽组小鼠的SOD、GSH-Px 活力均极显著性上升（P＜0.01），表明骨胶原肽能增强小鼠的抗氧化能力，减缓DSS 造成机体的氧化应激反应。

图6 骨胶原肽对结肠炎小鼠结肠组织LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力的影响Fig.6 Effects of TBCP on LPS,DAO content and SOD,GSH-Px activity in colonic tissue of colitis mice

3 讨论

UC 模型的建立是研究生理病理工作的第一步，近年来，关于UC 在研究中常用的动物疾病模型建立方法，大致可以分为化学药物诱导、免疫学方法诱导和通过基因工程技术诱导[24]。常用的化学诱导剂有TNBS、恶唑酮、醋酸、葡聚糖硫酸钠等，其中葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎模型与人类溃疡性结肠炎病变相似，并且简单易行，成功率高，重复性好[25]，所以成为试验研究中常用的建模方法。

主流学说认为UC 发病与细胞免疫、氧化应激和自身免疫有关，认为自身免疫异常和氧化应激功能障碍在其发病机制中起到了重要的作用[26]。当生物体处于正常状态时，由于其本身存在一套完整且相互制约平衡的氧化和抗氧化防御系统[27]，因此能够很好地防止活性氧对组织和细胞的损伤，而过量产生的活性氧是诱导UC 发病过程中组织损伤和溃疡形成的关键因素。SOD 作为催化超氧化物歧化的酶，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，能够清除自由基，延缓衰老，并且在临床上有治疗炎症的作用[23]，GSH-Px 不仅可以清除脂质过氧化物和过氧化氢，还可以通过再酰化抑制脂质过氧化的再生[28]。SOD 和GSH-Px 酶活的提高能够稳定细胞膜，对结肠组织起保护作用[29]。LPS 作为内毒素在结肠释放后会引发结肠炎患者肠道炎症反应及微生物生态失调[30]，故而LPS 含量能够间接反应肠道黏膜免疫屏障的损伤程度。当肠道黏膜屏障遭到破坏，肠黏膜通透性升高，肠黏膜上皮细胞胞内释放DAO 含量增加，并进入肠细胞间隙、淋巴管和血液，DAO 水平定性地反应肠道损伤和修复情况。

4 结论

本实验选择采用3.5% DSS 溶液自由饮用8 d诱导急性溃疡性结肠炎小鼠模型，以评价金枪鱼骨胶原肽对DSS 诱导小鼠急性结肠炎的预防效果。造模第3 d 开始，小鼠粪便呈隐血阳性，第5 d 出现肉眼可见血便或稀便，同时伴随体重下降、饮食饮水量减少、活动减少和毛色变差等症状，随着造模时间的延长愈加明显。同时，实验结果显示，与正常组相比，DSS 造模组小鼠DAI 评分升高，肝脾指数升高（P＜0.05），胸腺指数降低（P＜0.05），结肠长度缩短（P＜0.05），结肠隐窝与腺体破坏严重，杯状细胞缺失，大量炎细胞浸润，以上结果表明急性结肠炎造模成功。预防性的提前给予骨胶原肽能够减轻急性结肠炎的症状，增加结肠长度（P＜0.05），对结肠组织病理学进行观察，以中性粒细胞、淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，杯状细胞缺失等病理改变亦得到了一定程度的减轻。因此推测金枪鱼骨胶原肽对于DSS 诱导的急性溃疡性结肠炎具有一定的预防作用。

此外，金枪鱼骨胶原肽均能使血清和结肠组织中的SOD 和GSH-Px 酶活力极显著增加（P＜0.01），与刘宁等[31]从抗氧化角度研究发酵豆乳对DSS 诱导溃疡性结肠炎大鼠起保护作用的结果相符。这表明金枪鱼骨胶原肽具有一定的抗氧化能力，可能通过清除体内过量活性氧、抑制脂质过氧化反应的方式对急性溃疡性结肠炎起到预防作用。另外，预防性的提前给予金枪鱼骨胶原肽能极显著降低血清和结肠组织中LPS 和DAO 的含量（P＜0.01），这与徐凤等[32]、钟元帅等[33]的研究结果相似，表明金枪鱼骨胶原肽能在一定程度上修复受损的肠道黏膜。综上所述，本研究表明金枪鱼骨胶原肽对DSS 诱导的溃疡性结肠炎具有显著的预防效果，推测其通过提高机体的抗氧化能力，修复肠道黏膜屏障损伤发挥作用。研究结论提示，采用金枪鱼鱼骨胶原肽预防结肠炎具有可行性，并且对金枪鱼骨资源的开发利用具有一定的积极意义。