广西大肠杆菌对多种抗菌药物的耐药率及部分耐药基因检测

罗远燕 , 陈心瑜 , 陈 鑫 , 杜倩笙 , 庞燕丽 , 劳承连 , 李 崇 , 王莉贞 , 司红彬

(广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004)

大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coil)属于革兰阴性菌，广泛存在于自然界，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起仔猪黄、白痢和仔猪水肿病，同时可引起发病率和死亡率普遍较高的其他兽医临床常见病[1]。此外，致病性大肠杆菌主要以家畜、家禽及其制品为主要传播载体，可引起食物中毒、胃肠炎等肠道疾病，甚至导致死亡[2]。在一些资源贫乏的环境中，如条件恶劣的养殖场等，由于过度拥挤、卫生条件差、环境复杂，更加有助于多种抗药性大肠杆菌的传播[3]。近年来，随着越来越多的抗菌药物被广泛使用，使得耐药菌株不断出现，菌株的耐药谱也在不断扩大，加剧了抗菌药物在畜禽体内的残留，导致动物源性食品中大肠杆菌耐药性的加剧[4]。

为了解广西地区大肠杆菌对常用抗菌药的耐药情况及其所含耐药基因型，本试验对广西大学动物科学技术学院中兽医实验室分离鉴定后甘油保藏的113株大肠杆菌进行药敏试验和相关耐药基因型的检测，旨在为兽医临床大肠杆菌耐药性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 113株广西大学动物科学技术学院中兽医实验室在广西区域内分离鉴定后甘油保藏的大肠杆菌菌株。麦康凯琼脂、营养肉汤(NB)、伊红美蓝琼脂，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。选用头孢噻呋钠、阿米卡星、阿莫西林、磺胺间甲氧嘧啶等 13 种临床上常用的抗菌药物，用蒸馏水稀释至终浓度为6 400 μg/mL；氟苯尼考为5 120 μg/mL[5]；加替沙星为3 200 μg/mL。革兰染液；TE缓冲液；TaqPCR Master Mix；DNA marker D；Regular Agarose G-10(BIOWEST)。

1.2 仪器与设备 GE9612T PCR扩增仪，杭州柏恒科技有限公司；P25T电泳仪，Biometra公司；1600R凝胶成像仪， Tanon公司；5418R离心机，Eppdorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种复苏 从甘油保藏菌种中吸取100 μL加入至3.5 mL NB肉汤试管当中，放入恒温培养振荡器(37 ℃，220 r/min)生长12 h。

1.3.2 大肠杆菌最小抑菌浓度(MIC)测定 以2011年美国临床实验室标准化协会(CLSI) 推荐的方法和结果判定标准，采用2倍微量稀释法测定大肠杆菌对常用13种抗菌类药物的最小抑菌浓度(Minimal inhibiton concertration，MIC)，13种抗菌类药物包括：β-内酰胺类：头孢曲松钠、头孢他啶、头孢噻呋钠、阿莫西林、头孢噻肟钠、美罗培南；氟喹诺酮类：环丙沙星、加替沙星、左旋氧氟沙星；磺胺类：磺胺间甲氧嘧啶；氨基糖苷类：阿米卡星；氯霉素类：氟苯尼考；多磷类：磷霉素。其中，氟苯尼考的耐药折点参考文献[6]报道。

1.3.3 耐药基因的检测 用煮沸法[7]提取大肠杆菌DNA，将细菌接种于 NB 肉汤中，37 ℃振荡培养 12～24 h，吸取2 mL于2 mL EP管内，12 000 r/min离心3 min，去上清液，加入200 μL的TE缓冲液，沸水浴10 min后，12 000 r/min离心3 min取上清液分装，放入4 ℃冰箱保存供试验使用。

PCR反应体系(25 μL)：Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，超纯水8.5 μL。PCR反应条件：顶盖温度94 ℃，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火(温度如表1所示)30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳45 min后，在紫外投射仪下观察结果并用凝胶成像系统摄影。

表1 耐药基因引物信息Table 1 The information of drug resistance gene primer

2 结果

2.1 大肠杆菌最小抑菌浓度(MIC) 如表2结果所示，在113株大肠杆菌中，MIC各浓度分布不尽相同。其中大肠杆菌对头孢噻呋钠及磺胺间甲氧嘧啶2种药物的MIC主要集中在MIC≥3 200 μg/mL范围内，具体MIC≥3 200 μg/mL的细菌比例分别占92.6%和90.2%。然而，大肠杆菌对美罗培南的MIC分布主要集中在≤1.562 5 μg/mL，比例为96.46%(109/113)。另外根据数据统计，其中对3种及3种以上药物MIC≥3 200 μg/mL的菌株有42株， 占37.2%。

在113株菌中，耐药情况各有差异，其中头孢噻呋钠及氟苯尼考的耐药率最高，达99.1%。其次，磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、环丙沙星、头孢噻肟钠、头孢曲松钠、左旋氧氟沙星、加替沙星、头孢他啶、磷霉素的耐药率较高，分别为93.5%、92.9%、91.1%、89.9%、73.4%、72.5%、69.4%、56.6%、50.5%。分离的菌株对于抗菌药阿米卡星、美罗培南敏感，其耐药率仅为32.7%、3.5%，结果见表2、表3。

大肠杆菌对氟苯尼考的MIC分布主要在640 μg/mL、 1 280 μg/mL、≥2 560 μg/mL这3个浓度，分别占29.2%(33/113)、32.74%(37/113)、28.31%(32/113)，总体对氟苯尼考的耐药率为99.1%，见表3。

表3 大肠杆菌对氟苯尼考的最小抑菌浓度及耐药率Table 3 The minimum inhibitory concentration and resistance rate of E. coli to florfenicol

2.2 大肠杆菌耐药基因PCR扩增结果 从试验菌株中选取对3种或3种以上药物MIC≥3 200 μg/mL的42株细菌，采用PCR法分别检测其blaTEM基因、blaCTX-M-9基因、sul2基因，试验阳性对照与阴性对照基本符合预期设计。

由表4可知，在选取的42株菌中，有23株检测出含有耐药基因，占53.4%(23/42)，已超过半数，本次试验检出携带blaTEM基因、blaCTX-M-9基因、sul2基因分别为19.0%、38.1%、45.2%。

表4 耐药基因的PCR扩增结果统计Table 4 Statistics of PCR amplification results of drug resistance genes

3 讨论

本药敏试验结果表明，复苏培养的113株大肠杆菌对常见抗菌药耐药情况各不相同，但其耐药情况总体趋于严重，主要体现在耐药率和耐药水平较高，细菌耐药菌谱广。其中，本试验复苏大肠杆菌对β-内酰胺类耐药率为69.2%，该结果比近年来福建地区高，但是略低于河南地区(超过70%)，与扬州地区宠物源性大肠杆菌耐阿莫西林(59.73%)、头孢曲松钠(44.23%)、头孢噻呋钠(21.68%)[8]结果相比，本试验结果细菌耐药率则普遍偏高，大肠杆菌对该类抗菌药物耐药性较强。另外，氯霉素类氟苯尼考耐药率为99.1%，该结果高于河南地区>60%、福建地区73.7%、扬州59.29%，表现为耐药。细菌对磺胺类耐药率为99.1%，其结果与广州地区99.13%相近，略高于福建地区93.8%及河南地区94.6%，均表现较强的耐药性[1,10]。对于氨基糖苷类药物阿米卡星耐药率为32.7%，则明显低于秦皇岛犊牛源大肠杆菌83.3%[11]。

在广西地区，大肠杆菌对个别抗菌药物存在较高的耐药性，且耐药率较稳定，但对大部分抗菌药物耐药率明显上升。其中β-内酰胺类药阿莫西林耐药率(92.9%)，与冯世文等[12]2016年对广西猪源致病性大肠杆菌耐药性结果(97.1%)接近，而头孢曲松钠、阿米卡星的耐药性与其3.9%、16.5%结果比较则呈明显上升趋势。氟苯尼考耐药率与2009年谢永平等[13]对广西地区猪源大肠杆菌耐药性检测结果17.8%对比，耐药率明显升高。

此外，大肠杆菌的耐药基因检出率偏高。目前在所检测的42株菌中，sul2耐药基因检出率最高(45.2%)，与贵州地区(77.3%)相比检出率偏低[14]，但是远高于西藏地区[15]牦牛源大肠杆菌(4.92%)。ESBLs基因(blaTEM和blaCTX-M-9)的检出率为57.1%，其中blaTEM检出率与广州地区猪源大肠杆菌73.81%相比偏低[12]。

综上所述，本试验从广西地区分离的大肠杆菌菌株耐药性及耐药基因检出率出发，与不同地区分离的大肠杆菌耐药情况作比较。结果表明，不同地区分离大肠杆菌对抗菌药物的耐药率均有所不同，就广西地区而言，其大肠杆菌对常见抗菌药物耐药情况趋于严重，近年来耐药率呈升高趋势，ESBLs耐药基因及磺胺类sul2耐药基因检出率偏高。从理论数据上看，对于广西地区内动物大肠杆菌病的治疗，使用磺胺类及β-内酰胺类药物效果不甚明显。