HLA-DQA1基因多态性与视神经脊髓炎的相关性研究

周莉莉 朱师国 黄诗诗 朱兰兵 王建勇 张雄 何志勇

视神经脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是主要累及视神经及脊髓的中枢神经系统免疫炎性脱髓鞘疾病[1]，其病因及发病机制至今尚不清楚。遗传因素在NMO发病机制中的作用日益受到重视。近年来，欧洲开展了较大规模的全基因组关联研究，发现了位于人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因的一个易感区域HLA-DQA1，该区域中的rs28383224位点与NMO相关性较强[2]。HLA在机体免疫应答和免疫调节中起关键作用。有研究发现免疫反应和炎症参与NMO疾病过程，在NMO的发生和发展中有着重要作用[3-4]，HLA-DQA1区域可能是导致NMO的重要遗传因素。尽管国内外一些学者己经对HLA基因多态性与NMO易感性的关联作了相关研究，但由于等位基因及其频率存在种族及地区差异性，各地研究结果不一，故目前尚无定论。本研究分析HLA-DQA1基因多态性与汉族人群NMO的相关性，探讨NMO的发病机制，为早期诊断及治疗提供帮助，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2015年1月至2020年5月就诊于温州医科大学附属第二医院脱髓鞘专病门诊的NMO确诊患者（NMO患者组）51例，其中男8例，女43例，年龄 10～83（46.31±17.27）岁；扩展残疾状况（expanded disability status scale，EDSS）评分为（2.66±2.12）分。NMO诊断标准参考Wingerchuk等[5]2015年的提议：（1）血清水通道蛋白 4（acquaporin 4，AQP4）-IgG 阳性：至少有一个核心临床特征；AQP4-IgG阳性（细胞转染法）；排除其他诊断。（2）AQP4-IgG阴性或AQP4-IgG状态未知：①在1次或多次临床发作中，至少2项核心临床特征并满足下列全部条件：至少1项临床核心特征为视神经炎、急性脊髓炎或延髓极后区综合征；空间多发（2个或以上不同的临床核心特征）；满足MRI附加条件；②检测AQP4-IgG阴性或未检测；③排除其他诊断。另选择同期本院健康体检者86例作为健康对照组，其中男16例，女 70 例，年龄 19～83（48.60±16.05）岁。两组对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。NMO患者组中合并干燥综合征4例，重症肌无力、桥本甲状腺炎、甲状腺功能亢进各1例。根据AQP4-IgG抗体检测结果将NMO患者组再分为AQP4-IgG阳性亚组43例和AQP4-IgG阴性亚组8例。本次研究经温州医科大学附属第二医院医学伦理委员会审查批准（批准文号：LCKY2019-159），两组对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 NMO患者组临床资料的收集 收集、分析AQP4-IgG阳性亚组和阴性亚组NMO患者的性别、年龄、发病年龄、EDSS评分、首发症状（包括视神经炎、脊髓炎、视神经炎合并脊髓炎、极后区症状）、合并免疫系统疾病、MRI表现（受累脊髓节段＞3、伴有颅内病灶）。

1.2.2 MRI检查方法 NMO患者组行MRI检查，使用MR专用的头颅线圈，用海绵垫固定患者头部。所有NMO患者组均使用美国GE Signal 3.0T超导型MR成像仪及相控阵头线圈。（1）头颅MRI成像序列：轴位自选回波T1WI、T2WI、水抑制反转回波成像及矢状位自选回波T1WI。（2）视神经MRI成像序列：轴位自选回波T1WI、T2WI、水抑制反转回波成像及矢状位自选回波T1WI。（3）脊髓MRI成像序列：矢状位快速自选回波T1WI、T2WI、脂肪抑制成像及轴位自选回波T2WI。增强MRI检查中，完成定位像扫描后，静脉注射对比剂钆喷酸葡胺（0.1 mmol/kg）20 ml，注射对比剂完毕后再依次进行矢状位、冠状位和轴位T1WI序列增强扫描。

1.2.3 基因型分析 （1）血液标本采集：分别抽取NMO两组受检者外周静脉血2 ml，用肝素抗凝，于-80℃冰箱保存。（2）血液标本基因组DNA的提取：采用德国Qiagen公司QIAmp血液基因组DNA提取试剂盒提取NMO患者组及健康对照组外周血DNA，用NanoDrop2000分光光度计测定DNA浓度及纯度，控制OD260/OD280在 1.7～1.8。（3）基因型检测：用 PCR 对 rs28383224位点进行扩增。其正向引物序列为F：5'CACTGTGGGATGAGGAGATGA 3'；反向引物序列为 R：5'CCATTGGCTCCCTTGATCCT 3'。用DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行切胶回收,用3730XL基因测序仪对PCR产物进行测序，由北京擎科生物科技有限公司完成。采用Sequencing Analysis 5.2软件对峰图数据进行分析，根据比对结果判读基因分型，并进一步进行比较分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 24.0统计软件。通过直接计数法对rs28383224位点基因型和等位基因频率进行计算。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布的计量资料以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用Mann-Whitney U及Wilcoxon W秩和检验。计数资料比较采用 χ2检验。相关性分析采用logistic回归。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP4-IgG阳性、阴性亚组患者临床资料比较 见表1。

由表1可见，AQP4-IgG阳性亚组和AQP4-IgG阴性亚组患者一般资料比较，差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。

表1 AQP4-IgG阳性、阴性亚组患者临床资料比较

2.2 MRI检查结果 NMO患者组中51例均完成了头颅MRI、脊髓MRI。头颅MRI检查发现大脑异常信号改变9例，延髓异常信号改变3例。脊髓MRI扫描显示有不同程度的脊髓受累35例。NMO患者组中30例患者完成了视神经MRI检查，其中发现视神经信号异常改变19例。视神经、脊髓典型病变见图1-3。

图1 1例56岁女性患者的视神经和颈髓MRI图像[a：冠状位T2WI压脂序列，显示左侧视神经高信号（箭头所示）；b：轴位T2WI压脂序列，显示右侧视神经肿胀，双侧视神经高信号（箭头所示）；c：颈髓矢状位脂肪抑制成像序列，显示C5～7平面脊髓增粗伴纵行条片状高信号影（箭头所示）]

图2 1例54岁女性患者的胸髓MRI图像[a、b：T2WI序列，显示C4～T10平面脊髓广泛异常信号（箭头所示）；c：增强MRI序列，显示胸髓不均匀强化（箭头所示）]

图3 1例62岁女性患者的头颅MRI图像[a：头颅T2水抑制反转回波成像序列，显示延髓极后区异常高信号（箭头所示）；b、c：MRI增强序列，显示延髓极后区及颈髓多发斑点状、小片状强化影（箭头所示）]

2.3 NMO患者组和健康对照组rs28383224基因检测结果比较 NMO患者组和健康对照组DNA片段测序图见图4（插页）。两组对象rs28383224基因型频率和等位基因频率分布见表2。

图4 视神经脊髓炎（NMO）患者组和健康对照组DNA片段测序图（箭头所示为rs28383224多态性位点的基因型）

由图4可见，经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，得出NMO患者组与健康对照组rs28383224位点的多态性基因型观测值与期望值检验符合Hardy-Weinberg（P＞0.05），表明两组研究对象具有较好的群体代表性。

由表2可见，两组对象rs28383224基因型频率和等位基因频率分布差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 NMO患者组和健康对照组rs28383224基因型频率和等位基因频率分布[例（%）]

通过logistic回归分析，提示rs28383224多态性与NMO发生风险无关联性（AG比AA：OR=1.028，95%CI：0.371 ～2.848，P=0.957；GG 比 AA：OR=0.672，95%CI：0.283～1.599，P=0.369，均 P ＞0.05）。

3 讨论

NMO是一种免疫介导的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，以视神经或脊髓相继或同时受累为主要表现，将引起不可逆的损伤，是中青年常见的致盲致残性疾病。2004年，NMO特异抗体AQP4-IgG确定为NMO的特异抗体[6]。随着对AQP4-IgG认识的深入和应用推广，2015年新的NMO谱系病国际诊断标准[5]，提出根据血清AQP4-IgG检测结果进行分层，包括AQP4-IgG阳性、AQP4-IgG阴性以及无法检测AQP4-IgG的NMO谱系病[7]。NMO的确切病因和发病机制尚未明确，目前认为其可能机制涉及免疫、遗传、环境等诸多因素，其中尤其是对遗传学因素研究甚少[8]。本研究比较了不同抗体类型NMO患者的临床特征，发现不同亚型患者临床症状有着明显差异，并对NMO的相关基因位点进一步深入研究。

目前NMO免疫学相关的病因错综复杂，其发病机制尚未完全阐明。人类主要组织相容性复合体通常被称为HLA，定位于人类第6号染色体短臂，呈高度多态性，有高度遗传多态性，各等位基因频率分布因不同种族、群体、地域而异，与许多自身免疫性疾病的遗传易感性密切相关，其基因多态性决定了HLA系统参与的免疫反应的多样性和复杂性。既往国内外关于NMO的遗传因素研究多集中于HLA基因。研究结果显示，90%以上的NMO患者与HLA等位基因DPB1*0501和DPB1*0301密切相关，其中亚洲人或黑种人NMO发病主要与DPB1*0501相关，而在白种人群中最常见的则是 DPB1*0301[9]。Wang 等[10]分析了 HLA-DRB1 和 HLADPB1等位基因在中国南方汉族人NMO发病中的作用，发现HLA-DRB1*0501与南方汉族人群AQP4-Ab阳性NMO发病风险相关。NMO易感性与不同HLA基因多态性相关可能由种族、地域不同所致，进一步支持了NMO的发病与遗传因素有关。

HLA-DQA1位于6p21.32，是一组免疫应答基因，Estrada等[2]对欧洲人的研究中发现HLA-DQA1和C4A/C4B位点与NMO存在密切相关性。同时后续有关HLADQA1与NMO的相关性研究如Ogawa等[11]，在日本人群中检测到HLA-DQA1*05:03位点与NMO的发病存在正相关，而HLA-DQA1*01:01、HLA-DQA1*03:02未发现与NMO的发病相关，表明HLA-DQA1基因的单核苷酸多态在不同人群中与NMO的相关性有一定的差异，其是否为NMO的危险因素还需进一步扩大其他国家或地区的调查研究。目前关于中国NMO患者与HLA-DQA1基因多态性研究报道尚较少见。本研究选取了HLA-DQA1区域中与NMO相关性最强的rs28383224在汉族人中进行了验证，采用具有灵敏度高、准确性强的基因测序法对51例NMO患者和86例健康对照者作了HLA-DQA1区域rs28383224的基因型分析，本研究结果暂不支持rs28383224多态性是汉族人群NMO的危险因素，但不能就此排除HLA-DQA1基因参与NMO发病的可能性。本研究结果一方面可能是由地区或者种族差异引起，另一方面可能我们的研究样本量相对较小。

由于NMO的易感性与多基因相关，除AQP-4等已知易感基因外，HLA-DPB、CD40、IL-17和 TNFSF4等候选基因也可能影响患者NMO易感性[12-15]。因此，需要后期进行多中心、大样本、大规模研究来证实，同时进一步探索NMO新的易感基因及保护基因。随着对NMO遗传机制认识及研究的不断深入，从基因遗传学方面加深对AQP4-IgG阳性及阴性NMO的再认识，针对性地为临床治疗提供新线索。