氯吡格雷上调长链非编码RNA-4231减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

刘婷婷 宋巧凤 王希柱 闫玉敏 刘小雪

冠状动脉旁路移植术等血管再通术治疗缺血性心脏病时易造成心肌缺氧/复氧(H/R)损伤。心肌细胞氧化应激、凋亡等可加重H/R损伤[1-4]。氯吡格雷属于抑制血小板聚集的噻吡啶类衍生物，可用于缺血性疾病的治疗[5]，但对心肌H/R损伤的治疗效果及可能机制尚不明确。长链非编码RNA-4231(lncRNA-4231)表达上调可保护心肌细胞[6]。本研究建立心肌细胞H/R损伤模型，探讨氯吡格雷对H/R诱导心肌细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响及其对lncRNA-4231的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯吡格雷购自乐普药业股份有限公司；大鼠H9c2心肌细胞购自美国ATCC公司；DMEM、胎牛血清购自美国Gibco公司；甲基噻唑基四唑(MTT)、Annexin V-FITC/PI购自美国Sigma公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂购自北京全式金生物技术有限公司；反转录与荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；pcDNA3.1购自上海索宝生物科技有限公司。

1.2 实验分组

取对数生长期H9c2心肌细胞接种于96孔板(5×103/孔)，分别加入不同浓度(H/R组0、低剂量药物组12.5 μg/mL、中剂量药物组25 μg/mL、高剂量药物组50 μg/mL)的氯吡格雷处理24 h，将H9c2细胞置于缺氧装置(95%N2、5%CO2)中处理24 h，转移至正常培养箱(95%O2、5%CO2)内复氧处理6 h，进行H/R处理[7]。将正常培养的H9c2细胞作为对照组。

分别将pcDNA、pcDNA-lncRNA-4231转染至H9c2心肌细胞，随后进行上述H/R处理，分别记作pcDNA组、pcDNA-lncRNA-4231组。

1.3 MTT检测细胞增殖

收集各组心肌细胞接种于96孔板(1×104个/孔)，每孔加入MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，孵育5 min，检测各孔吸光度值(OD值)。细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

收集各组心肌细胞，加入预冷PBS洗涤，参照凋亡试剂盒说明书操作，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 检测MDA、SOD的水平

收集各组心肌细胞，加入RIPA裂解液，4 ℃条件下3 000 转/min离心10 min，吸取上清液，根据试剂盒说明书检测MDA水平及SOD的活性。

1.6 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中lncRNA-4231的表达水平

收集各组心肌细胞，采用Trizol法提取细胞中的总RNA，检测RNA浓度，将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板行qRT-PCR。qRT-PCR反应体系：cDNA 2 μL，Real-time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μL；反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次)。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA-4231的相对表达水平。

1.7 Western blot检测活化胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表达水平

RIPA裂解液提取各组心肌细胞总蛋白，检测蛋白浓度，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜、封闭，分别加入一抗稀释液与二抗稀释液，滴加ECL显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.8 统计学分析

采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氯吡格雷对H/R后心肌细胞活性及凋亡的影响

与对照组比较，H/R组细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，cleaved caspase-3蛋白表达水平显著升高(P均<0.05)；与H/R组比较，中剂量药物组、高剂量药物组细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低，cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低(P均<0.05)；低剂量药物组与中剂量药物组、中剂量药物组与高剂量药物组各指标的差异均具有统计学意义(P均<0.05)，见图1、图2、表1。

表1 氯吡格雷处理后各组心肌细胞存活率、凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表达水平比较

图1 氯吡格雷对心肌细胞凋亡率的影响

图2 氯吡格雷对心肌细胞cleaved caspase-3蛋白表达水平的影响

2.2 氯吡格雷对H/R后心肌细胞中MDA、SOD的影响

与对照组比较，H/R组MDA的水平显著升高，SOD的活性显著降低(P均<0.05)；与H/R组比较，中剂量药物组、高剂量药物组MDA的水平显著降低，SOD的活性显著升高(P均<0.05)；低剂量药物组与中剂量药物组、中剂量药物组与高剂量药物组MDA、SOD的差异均具有统计学意义(P均<0.05)，见表2。

表2 氯吡格雷处理后各组心肌细胞MDA、SOD水平比较

2.3 氯吡格雷对H/R后心肌细胞lncRNA-4231表达的影响

与对照组比较，H/R组lncRNA-4231的表达水平显著降低(0.21±0.01对0.96±0.05，P<0.05)；与H/R组比较，中剂量药物组(0.50±0.03)、高剂量药物组(0.83±0.04)lncRNA-4231的表达水平均显著升高(P均<0.05)，且高剂量药物组显著高于中剂量药物组(P<0.05)。

2.4 lncRNA-4231对H/R后心肌细胞活性及凋亡的影响

与pcDNA组比较，pcDNA-lncRNA-4231组细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低，cleaved caspase-3蛋白水平显著降低(P均<0.05)，见图3、图4、表3。

表3 过表达lncRNA-4231后两组心肌细胞活性及cleaved caspase-3蛋白表达水平比较

图3 lncRNA-4231对心肌细胞凋亡率的影响

图4 lncRNA-4231对cleaved caspase-3蛋白表达水平的影响

2.5 lncRNA-4231对H/R后心肌细胞中MDA、SOD的影响

与pcDNA组比较，pcDNA-lncRNA-4231组MDA水平显著降低[(44.82±1.10) μmol/L对(79.89±1.64) μmol/L，P<0.05]，SOD活性显著升高[(58.94±1.50) U/mL对(26.62±1.76) U/mL，P<0.05]。

3 讨论

心肌细胞H/R损伤可导致心力衰竭等疾病的发生，减轻心肌细胞H/R损伤是血管再通治疗的关键环节。研究显示，五味子乙素等药物可能通过靶向调控某一基因的表达，减轻心肌细胞内质网应激损伤，抑制细胞凋亡，从而保护心肌细胞[8-10]。

氯吡格雷可降低机体炎性反应，改善急性心肌梗死患者临床症状及体征[11]，可通过改善急性冠脉综合征患者血管内皮功能减缓疾病发展[12]，还可改善冠状动脉粥样硬化性心脏病合并脑梗死患者神经功能及凝血功能[13]。本研究探讨氯吡格雷对H/R损伤后心肌细胞保护作用的分子机制。研究结果显示，H/R处理后心肌细胞存活率显著降低，凋亡率及cleaved caspase-3表达水平显著升高，而不同浓度的氯吡格雷处理后细胞存活率显著升高，细胞凋亡率及cleaved caspase-3表达水平均显著降低。caspase-3是细胞凋亡执行因子，当细胞接受凋亡信号时，caspase-3被激活形成cleaved caspase-3，促使细胞凋亡[14]。本研究结果提示氯吡格雷可抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡，促进细胞增殖。MDA属于过氧化物酶，其水平升高预示心肌细胞损伤加重，而SOD属于抗氧化酶，可通过清除氧自由基增强细胞抗氧化能力[15]。本研究结果显示H/R诱导的心肌细胞中MDA水平显著升高，SOD活性显著降低，而氯吡格雷处理后MDA水平显著降低，SOD活性显著升高，且呈剂量依赖性，提示硫酸氢氯吡格雷可抑制H/R诱导的心肌细胞氧化应激反应。

研究表明，抑制或促进长链非编码RNA(lncRNA)表达可减轻H/R诱导的心肌细胞损伤[16-17]，提示lncRNA在心肌H/R损伤中发挥重要调控作用。本研究结果显示H/R诱导的心肌细胞中lncRNA-4231的表达水平显著降低，而氯吡格雷处理后lncRNA-4231的表达水平显著升高，且呈剂量依赖性，提示氯吡格雷可能通过促进lncRNA-4231表达减轻心肌细胞H/R损伤。本研究进一步分析显示，lncRNA-4231过表达后H/R诱导的心肌细胞存活率显著升高，细胞凋亡率和cleaved caspase-3表达水平显著降低，且MDA水平显著降低，SOD活性显著升高，提示硫酸氢氯吡格雷可能通过促进lncRNA-4231表达，促进H/R诱导的心肌细胞增殖，抑制细胞凋亡和氧化应激。

综上所述，氯吡格雷可能通过上调lncRNA-4231的表达保护H/R后的心肌细胞，但lncRNA-4231的下游作用靶点尚需进一步探究。