淋巴细胞连接蛋白调控JAK-STAT信号通路在高血压血管重构中的作用

阿燕·西合斯 罗健 邵明明 张玉玺 张源明 王凌鹏

淋巴细胞连接蛋白(LNK)是人类高血压的关键驱动因素[1]。该蛋白上有多个酪氨酸磷酸化位点，可作为受体被磷酸化，在不同细胞信号通路如Janus激酶(JAK)/信号转导与转录激活子(STAT)信号通路中发挥作用[2]。研究发现，JAK-STAT信号通路激活能够调节血管内皮生长因子、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的局部合成，参与高血压的发生发展[3-4]。本研究前期预实验表明，高血压患者体内LNK与炎性细胞因子的表达存在相关性，LNK可能通过负性调控炎性细胞因子分泌，参与高血压的发生发展。本研究建立高血压血管平滑肌细胞模型，进一步探讨LNK介导的JAK/STAT信号通路在高血压血管重构中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

1.2 细胞培养

大鼠胸主动脉平滑肌细胞购自凯基生物。血管平滑肌细胞(VSMC)培养采用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基，于37 ℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中进行培养，0.25%胰酶消化后进行传代。培养瓶中细胞贴壁融合达90%时，加入10 μmol/L AngⅡ，继续干预24 h，构建高血压细胞模型。

1.3 pIRES2-LNK过表达质粒构建及细胞转染

1.4 实验分组及干预

将VSMC分为4组：对照组，正常培养VSMC 72 h；AngⅡ组，正常培养VSMC 48 h后，加入AngⅡ干预24 h；AngⅡ+空载组，转染pIRES2-EGFP空载质粒72 h，转染结束前24 h加入AngⅡ干预VSMC细胞24 h；AngⅡ+LNK组，转染pIRES2-EGFP-SH2B3重组载体72 h，转染结束前24 h加入AngⅡ干预VSMC 24 h。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖水平

取VSMC，制备成5×104/mL单细胞悬液，接种至96孔板中，100 μL/孔，细胞贴壁后，弃去培养基，按照1.4进行实验分组并干预。干预完成后，弃去培养基，每孔加入100 μL 10%CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h后酶标仪测定450 nm处的吸光值，即为所需记录的光密度(OD)值。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率

将干预后的各组VSMC制成单细胞悬液，加入5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-AAD，4 ℃避光放置5 min后用流式细胞仪在激发波长488 nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析，检测并记录细胞周期、凋亡率。

1.7 实时荧光定量PCR检测mRNA表达水平

收集干预后的各组VSMC，以β-actin为内参，使用Trizol提取总RNA，核酸蛋白定量仪测定RNA浓度及纯度。采用全式金生物公司的TransZol Up和cDNA合成试剂盒进行反转录，反应条件为25 ℃ 10 min，85 ℃ 5 s，引物见表1。cDNA使用实时荧光定量PCR试剂盒QuantiNava SYBR Green Kit进行定量PCR反应，检测LNK、STAT3、JAK2的mRNA表达水平，反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，用2-△△Ct法计算各基因mRNA的相对表达水平。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.8 Western blot检测蛋白表达水平

收集干预后的各组VSMC，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂奶粉的封闭1 h，LNK、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h。采用ECL化学发光底物进行显色反应，用ImageJ软件进行灰度分析。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.9 统计学分析

运用SPSS 19.0软件对各组数据进行统计学分析，计量资料采用均值±标准差表示。若数据符合正态分布，采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD方法进行多重比较，方差不齐时采用Tamhane方法进行多重比较。若数据不符合正态分布，先对数据进行对数转化，使数据正态化，再对数据进行上述单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组VSMC增殖水平比较

AngⅡ组(1.482±0.104)和AngⅡ+空载组(1.480±0.092)VSMC增殖水平明显高于对照组(1.244±0.046)，而AngⅡ+LNK组(1.263±0.053)中VSMC增殖水平明显低于AngⅡ组和AngⅡ+空载组(P均<0.05)。

2.2 各组VSMC凋亡率比较

AngⅡ组[(4.503±0.223)%]和AngⅡ组+空载组[(3.837±0.546)%]VSMC凋亡率明显低于对照组[(5.723±0.110)%]，而AngⅡ+LNK组[(5.210±0.053)%]中VSMC细胞凋亡率明显高于AngⅡ组和AngⅡ+空载组(P均<0.05)。见图1。

注:A为对照组；B为AngⅡ组；C为AngⅡ+空载组；D为AngⅡ+LNK组

2.3 各组VSMC细胞周期比较

与对照组比较，AngⅡ组和AngⅡ+空载组VSMC处于细胞休眠期(G0期)/DNA合成前期(G1期)的比例减少，处于DNA合成期(S期)、 DNA合成后期(G2期)/分裂期(M期)的比例增加(P均<0.05)。与AngⅡ组比较，AngⅡ+空载组VSMC处于S期的比例减少，处于G2/M期的比例增加，AngⅡ+LNK组VSMC处于G0/G1期的比例增加，处于S期的比例减少(P均<0.05)。与AngⅡ+空载组比较，AngⅡ+LNK组VSMC处于G0/G1期的比例增加，处于S期、G2/M期的比例减少(P均<0.05)。 见表2、图2。

表2 各组VSMC细胞周期比较/%

注：A为对照组；B为AngⅡ组；C为AngⅡ+空载组；D为AngⅡ+LNK组

2.4 各组SH2B3、STAT3、JAK2的mRNA表达水平比较

AngⅡ组、AngⅡ+空载组VSMC中编码LNK的SH2B3基因的mRNA表达水平明显低于对照组，AngⅡ+空载组中SH2B3的mRNA表达水平明显低于AngⅡ组, AngⅡ+LNK组中SH2B3的mRNA表达水平明显高于对照组、AngⅡ组和AngⅡ+空载组(P均<0.05)。AngⅡ组、AngⅡ+空载组中STAT3及JAK2的mRNA表达水平均明显高于对照组，AngⅡ+LNK组中STAT3及JAK2的mRNA表达水平均明显低于AngⅡ组和AngⅡ+空载组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组SH2B3、STAT3、JAK2的mRNA表达水平比较

2.5 各组SH2B3、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2的蛋白表达水平比较

AngⅡ组和AngⅡ+空载组的SH2B3蛋白表达水平明显低于对照组，AngⅡ+LNK组的SH2B3蛋白表达水平明显高于对照组、AngⅡ组和AngⅡ+空载组(P均<0.05)。AngⅡ组和AngⅡ+空载组p-STAT3、p-JAK2的蛋白表达水平均明显高于对照组，AngⅡ+LNK组p-STAT3、p-JAK2的蛋白表达水平均明显低于AngⅡ组和AngⅡ+空载组(P均<0.05)，见表4、图3。

表4 各组SH2B3、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2的蛋白表达水平比较

图3 各组VSMC细胞中SH2B3、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2的蛋白表达情况

3 讨论

高血压的主要特点是血压升高和由其导致的血管重构[5-6]。研究血管重构的关键环节可能有助于控制高血压。人体内LNK由12号染色体上的SH2B3基因编码，参与细胞因子信号转导的调控[7]，可以介导各种炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、γ干扰素(INF-γ)等的表达。研究表明LNK与高血压具有相关性[8-10]。

本研究结果显示，高血压模型组即AngⅡ+空载组VSMC主要处于S期、G2/M期，且凋亡率低，提示VSMC处于增殖期，AngⅡ+LNK组VSMC主要处于G0/G1期，凋亡率增加，提示VSMC处于休止期，细胞增殖、血管重构受抑，这提示LNK可能通过抑制高血压血管平滑肌细胞的增殖，减少血管重构，从而影响高血压的发生发展。

JAK/STAT是LNK的经典信号通路，广泛表达于多种细胞和组织中，参与调控细胞的增殖、凋亡、转化、细胞免疫等过程[11-14]。Satou等[15]研究表明，JAK/STAT信号通路在AngⅡ依赖性高血压的发生发展中起着重要作用。JAK/STAT信号通路在最初发现时被认为是造血和免疫细胞中干扰细胞内信号转导的主要介质。研究发现，JAK激酶和STAT蛋白特异性表达于血管壁中，并转导各种受体家族的细胞内信号，参与细胞凋亡相关因子、生长因子和血管活性肽的表达[16]。JAK可直接与1型血管紧张素(AT1)受体结合[17]，增强其在血管中的磷酸化。本研究结果显示，AngⅡ+LNK组中STAT3、JAK2的mRNA表达水平和p-STAT3、p-JAK2的蛋白表达水平均明显低于AngⅡ组和AngⅡ+空载组，提示LNK可能通过JAK/STAT信号通路参与高血压的血管重构。JAK2、STAT3可加剧内皮细胞的炎性反应，研究表明AngⅡ能引起心肌细胞 STAT3的双相激活，JAK2/STAT3信号通路抑制AngⅡ诱导的细胞重构[14]。JAK2/STAT3 信号通路可以改善妊娠高血压大鼠血管内皮细胞的分泌功能，抑制大鼠血管重构[18]。本研究建立高血压模型，发现LNK蛋白在高血压中处于低表达状态，且发现LNK蛋白通过负性调节JAK-STAT信号通路抑制了高血压的血管重构。