电化学生物传感器及其检测大肠杆菌的研究

曹卓松，孙飞龙，李辰宇，杨晓波，王尚，薛斌，赵辰，张曦，谌志强，王景峰，邱志刚*

（1.西安工程大学环境与化学工程学院，陕西 西安 710600；2.军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津 300050）

电化学生物传感器是通过测量电化学信号检测微生物的生物传感器，这种传感器是以生物敏感材料（如抗体等）作为识别元件特异性识别待测物，以电极（如玻碳固体电极等）作为转换元件将物理或化学变化转换为电信号，通过信号放大并处理从而实现定性或定量分析待测物[1]。近年来电化学生物传感器随着材料、生物、电化学等学科的快速发展也取得了巨大进步，各领域学者也报道了大量新型电化学生物传感器。

大肠杆菌是广泛存在于水体中的一类致病菌，人体感染其可引起阑尾炎、胆囊炎等疾病，严重情况甚至可导致死亡[2-3]。传统检测大肠杆菌的方法主要有操作复杂、检测耗时长的滤膜法、多管发酵法等，其缺点是很难满足污染源快速检测的需求。近年来发展的许多检测方法[如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[4-5]、免疫学检测[6-7]等]均具有独特优势，但仍达不到现场检测的时间要求。因此，电化学生物传感器因其灵敏度高、特异性强、耗时短的优势迅速发展起来。

本文介绍了电化学生物传感器的检测原理及常用的检测技术，探讨了电化学生物传感器在大肠杆菌检测方面的传感原理及应用成果，并对电化学生物传感器发展前景进行了展望。

1 大肠杆菌

1.1 生物学特性及致病性

大肠杆菌，又称大肠埃希氏菌（Escherichia coli），是一种两端钝圆的短杆菌，属肠杆菌科、埃希氏菌属，革兰氏阴性菌种，大量存在于恒温动物肠道内，是肠道内正常栖息菌，可随粪便排出后在自然界广泛散播，因此环境内检出大肠杆菌则表明被粪便感染。所以从大肠杆菌被发现开始，其就被作为食品类粪源污染的卫生学指标及水体卫生学检测的微生物指标[8]。

大部分大肠杆菌无致病性，少部分菌种可产生肠毒素，能导致肠胃炎等疾病，是食物中毒主要原因之一[9]。若人体其他组织器官遭到大肠杆菌侵染，还可引起尿道炎、膀胱炎等疾病，甚至还能导致免疫力较弱人群引起败血症[10]。

1.2 检测方法研究现状

目前世界普遍采用的大肠杆菌检测方法有稀释平板计数法、多管发酵法和滤膜法[11]。其中前两者适用范围广，但操作繁琐耗时长；而滤膜法仅适用于杂质较少的水样，较前两者操作相对简单；这几种传统方法在检测周期、检测效率等方面都存在不足，无法满足快速检测的需求[12]。近年来除了传统的检测方法外，在各界学者的大量研究下也发展了许多检测大肠杆菌的新方法，如PCR法、免疫法、酶底物法、电化学法等。

PCR技术，在检测大肠杆菌方面具有快速灵敏等优势，其原理是以扩增的目标DNA为模板，将与模板互补的寡核苷酸片段作为引物，在DNA聚合酶作用下沿着模板延伸至完成新的DNA的合成，目前大肠杆菌PCR技术主要是针对致病性大肠杆菌的致病基因[13]。但该方法也存在反应效率差异大、扩增产物长度有限等不足。

免疫法是基于抗原抗体之间特异性反应进行检测的一种方法，其通过对反应物进行示踪物标记，利用抗原或抗体进行快速定量检测。免疫法在检测大肠杆菌方面主要方法有免疫磁珠法、酶联免疫吸附法、荧光免疫法等[14]。免疫法具有特异性强、耗时短、灵敏度高等优势，但待测物抗体的制备较为复杂。

酶底物法基于微生物代谢过程中产生的特异性酶可以专一地催化底物的原理对微生物进行检测，大肠杆菌较其他微生物特有的酶是β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，该酶通常作为大肠杆菌标志酶[15]。基于β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶检测大肠杆菌的方法被广泛应用，也研究了多种可用于显色反应或荧光反应的催化底物。虽然该方法在特异性方面有出色表现，但技术本身的局限性导致了其灵敏度不高。

电化学法是通过制备电化学生物传感器，利用微生物的物理、化学或电学变化及独特的电化学性质进行分析的研究方法。电化学检测大肠杆菌的方法常分为3类：基于标记的间接检测方法、基于无标记的直接检测方法、基于微生物代谢的检测方法。电化学方法得以广泛研究应用的主要原因在于其具有较高的准确度和灵敏度，且检测范围广、特异性强、耗时短，重要的是其可以通过与其他技术联用以满足不同的需求。

2 电化学生物传感器技术研究进展

2.1 检测原理

电化学检测原理是复相化学反应，一般反应形式如公式（1）所示。

式中：O为化合物的氧化态，R为还原态，ne为氧化还原反应转移的电子。电极表面反应过程主要为：O从溶液中迁移至电极/溶液界面→O在电极表面吸附→O得电子还原为R→R从电极表面解析→R从电极/溶液界面迁移至溶液中，该过程为法拉第过程。电极表面的双电层结构（电极/溶液界面）相当于一个电容器，其具有电容特性，当电极电位改变时双电层充电或放电，该过程电子转移产生电信号，通过对电信号的采集处理即可实现对样品的检测。

稳态测量技术：电化学稳态是指电化学系统的参数（如电极界面状态、电流密度、电极电势等）没有变化或变化可忽略的状态。稳态系统的特点是稳态电流全部用于电化学反应，且电极界面上扩散层范围不变，扩散层厚度恒定。稳态法检测的是电极过程达到稳定状态后电流密度与电极电势的关系，此时电流密度与电极电势不随时间改变，外电路即代表速率。Rocchini等[16-17]学者利用稳态技术论述了极化曲线动力学计算对扫描速率的影响。值得注意的是，在使用固体电极时，随着测量时间的延长，电极表面状态及其表面积的变化情况逐渐累积，不可忽略。

暂态测量技术：暂态是当系统极化条件改变时电极经历的一段不稳定、变化的阶段，是电极从一个稳态向另一个稳态转变的过渡状态。暂态过程具有双电层充电电流，且电极附近液层中的电极电势、双电层结构、扩散层厚度、浓度梯度等参数均随时间变化。暂态法主要研究手段依据施加扰动信号的大小分类，小幅度扰动信号（浓差极化可忽略）采用等效电路研究，电极过程处于传荷过程控制，大幅度扰动信号（浓差极化不可忽略）采用方程解析法研究。暂态法主要可用于测量 i、k 等动力学参数[18-20]，双电层电容[21-22]、溶液电阻[23-25]等电化学参数，电沉积[26-27]、金属腐蚀[28-29]等表面状态变化快的体系。

2.2 技术分类

线性电势扫描法，在电化学分析中又称伏安法，是通过控制电极电势以恒定速率变化来测量电极电流的方法，其中常用的检测手段包括薄层伏安法、循环扫描法、循环伏安法等。一般情况下线性扫描有以下特点：测得的电流是电极双电层充电电流和放电电流之和；由于电势不断变化，因此双电层充电电流不为零；双电层电容随着电势变化而改变；而电势变化也导致反应速率改变。特别的是，如果电极表面在电势变化范围内不发生电化学反应，则相当于理想极化电极，测得曲线反映的即是双电层电容和电势的关系。

脉冲伏安法是通过消除充电电流进行研究的一种极谱技术，其具有分辨率高、灵敏度强等特点。该技术方法被广泛应用于痕量分析[30-32]的原因是其通过充分减少充电电流和毛细管噪声电流，提高了信噪比，使其达到极高的灵敏度。脉冲技术又可细分为常规脉冲伏安法、微分脉冲伏安法、差示脉冲伏安法、方波伏安法等，其中差示脉冲伏安法和方波伏安法是灵敏度最高的检测方法。

电化学阻抗法是属于暂态电化学技术的一类检测方法，其原理也是向电化学系统施加一个扰动信号，通过观测系统电信号响应分析系统电化学性质，特别的是其施加的电信号是不同频率的振幅较小的正弦电势波，测量的信号是电势与电流信号的比值（即阻抗）。由于电化学阻抗法向电极施加的是小振幅交流电信号，因此当频率足够高时其表面状态化和浓差极化不至太严重，且不会导致极化累积，避免了对电化学体系产生过大的影响。

3 电化学生物传感器检测大肠杆菌的进展

电化学生物传感器用于直接检测大肠杆菌的技术根据制造传感器的检测策略分为依赖标记的检测技术和无标记检测技术，其中依赖标记的电化学生物传感器采用间接检测法，一般情况下采用生物分子或其他理化分子（如酶、金属纳米颗粒等）对目标细菌进行标记，用于诱导电化学信号进行测量。而无标记检测技术是在电极表面固定生物受体（如抗体、核酸等）用于特异性识别，在不进行标记的条件下，通过细菌的附着引起电化学参数变化，从而直接检测目标细菌。除上述两种直接检测大肠杆菌的技术外，还有一种采用通过对大肠杆菌代谢产物进行定量分析从而间接检测大肠杆菌的技术，即基于微生物代谢的检测技术。

3.1 基于标记的间接检测传感器

Gehring等[33]基于酶联免疫法制备了酶联免疫磁电化学生物传感器，将大肠杆菌固定在免疫磁珠和酶结合抗体之间制成三明治结构，多孔板磁化石墨电极用于吸附被捕获的大肠杆菌，该传感器在缓冲溶液中检测限为3.3×103cfu/mL。由于传感器检测的电信号是由标签转换而来，则还有一种检测思路是采用多个不同的标签进行标记，从而实现对多个细菌进行同时检测。Viswanathan等[34]制备了一种可以同时检测大肠杆菌、沙门氏菌和弯曲杆菌的传感器，他们将这3种细菌分别用 Cd、Cu、Pb 标签标记为 E.coli-CdS、Salmonella-CuS、Campylobacter-PbS，并将这3种细菌的抗体功能化多壁碳纳米管-聚烯丙基胺修饰到丝网印刷电极表面，被标记的细菌被捕获后与特定的抗体结合并释放标记物金属离子，通过对不同金属离子的测定实现对不同细菌的定量检测，3种细菌检测限分别为0.8×103、0.4×103、0.4×103cfu/mL。

基于标记的电化学传感器优势在于其通过标记实现了对电信号的放大，从而降低了检测限、提高了特异性。但是，这类电化学传感器由于标记过程的复杂性而延长了检测时间、增加操作难度。

3.2 基于无标记的直接检测传感器

根据Wang等[35]的报道，天然细菌细胞膜厚度为5 nm～10 nm，因为膜的选择透过性所以细菌电阻为102Ωcm2～105Ωcm2，电容为 0.5 μF/cm2～1.3 μF/cm2，因此细菌在电极表面的附着可以引起电化学参数的变化。Zelada-Guillén等[36]制备了一种简单直接有效的传感器用于检测大肠杆菌，该传感器通过在修饰有单壁碳纳米管的玻碳电极表面固定适配子实现了对大肠杆菌的特异性检测，经过对食品样液预处理后，该传感器在牛奶中检测限达到6 cfu/mL，在苹果汁中达到26 cfu/mL。Li等[37]利用石英晶金电极制备了一种免疫传感器，该传感器先用蛋白A对电极进行简单修饰，然后用抗大肠杆菌抗体进行功能化，由于该传感器的电极表面积较大，从而可以捕获更多细菌，增大了电阻变化，该传感器检测限为103cfu/mL。

相较于基于标记的电化学传感器，无标记电化学传感器最大的优势在于检测时间短、检测过程简单，但是也存在检测限不够低、灵敏度不够高、电极再生困难等不足。

3.3 基于微生物代谢的检测传感器

活的微生物在生长代谢过程中加入某些特定介质后，能通过代谢时发生的氧化还原反应产生电信号，目前该技术主要基于传感器上的pH值、离子浓度、电阻等电化学参数的变化对细菌进行检测，多年来，依据对微生物代谢过程进行检测从而实现定量检测的传感器已不在少数[38-39]。

Sippy等[40]依据大肠杆菌在代谢过程中能产生分解过氧化氢的过氧化氢酶[41]的原理，通过检测大肠杆菌代谢消耗的过氧化氢的量实现了对大肠杆菌的定量检测，该传感器检测范围为20cfu/mL～2.0×107cfu/mL。程欲晓[10]通过对大肠杆菌溶液进行预处理，使代谢产物β-D-半乳糖苷酶释放到溶液中，再向溶液添加底物氨基酚-β-D半乳糖苷酶，利用代谢产物水解底物产生对氨基酚的反应，制备了大肠杆菌电化学传感器，传感器检测范围为50 cfu/mL～1.0×105cfu/mL。

基于微生物代谢的检测传感器在检测大肠杆菌方面具有方便快捷的独特优势，但仍存在特异性不高、灵敏度低等不足。

4 展望

由于大肠杆菌作为重要的环境监测指标且其在食品领域零容忍的政策，因此对大肠杆菌的检测有着较严格的标准，在电化学生物传感器方面也有灵敏度、特异性、稳定性、检测时间等指标的要求。近年来，随着纳米技术、小型芯片技术、丝网印刷技术在电化学领域的应用，电化学生物传感器也得到了迅速的发展，且逐渐被认为是微生物现场检测最具前景的检测方法。电化学生物传感器虽然有小型化、成本低、受样品影响小等优势，但在稳定性、易保存性、可再生性及批量生产实现商品化方面仍有较大发展空间，而且目前尚缺少对于电化学生物传感器的官方统一标准。因此，实现电化学生物传感器商业化仍任重道远。