响应面法优化荔枝壳总黄酮提取及抗氧化活性

黎克纯，卢建芳，2，韩妆，尹圆梦，刘细祥，3*

（1.广西民族大学化学化工学院，广西 南宁 530006；2.广西林产化学与工程重点实验室，广西 南宁 530006；3.广西多糖材料与改性重点实验室，广西 南宁 530006）

荔枝（Litchi chinensis）属于无患子科植物，是华南地区的重要亚热带水果之一。由于荔枝营养价值高，在中国大量种植，产量占世界总产量的65%～70%[1-2]。2018年预计荔枝总产量高达288万吨，比2017年总产量增加近50%[3]。但是荔枝容易发臭变坏，在储存和运输过程中有较高的保鲜要求[4]。荔枝采摘时节天气炎热，如果采后置于常温环境下，荔枝因水分损失果实将很快呈褐色甚至腐烂[5-8]。当果实失水褐变而失去营养价值后，将直接减少荔枝种植利润[9-10]。据统计，荔枝每年因储运过程中发臭腐烂而造成的损失总量占荔枝总产量的20%以上[11]，严重影响了荔枝的种植效益。为了提高荔枝种植产业的效益，有必要将荔枝直接加工生产成易于储运的荔枝功能食品[12]。但是对荔枝进行食品加工的过程中，会产生大量的废弃荔枝壳（占果实重的16%左右）[13]，目前荔枝壳处置方式大多为直接丢弃，既浪费资源又污染环境。研究表明，荔枝壳含有黄酮类、多酚类和多糖类等多种活性成分[14]，具有广阔的应用前景。然而，目前对于荔枝壳中总黄酮提取工艺及抗氧化性能研究较少[15-17]。因此，有必要进一步研究荔枝壳总黄酮提取工艺及抗氧化活性。本研究以广西荔枝食品深加工副产物荔枝壳为研究对象，采用乙醇浸提荔枝壳中总黄酮，进而用响应面法优化和评价乙醇提取荔枝壳总黄酮的工艺条件，并对从荔枝壳中提取的总黄酮进行抗氧化性能评价，以期为提高荔枝种植产业附加值提供一种新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荔枝：市售；冰乙酸、芦丁、九水合硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、无水乙醇、甲醇、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、铁氰化钾、三氯乙酸、六水氯化铁、N-（1-萘基）乙二胺盐酸盐、对氨基苯磺酸（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；盐酸（分析纯）：西陇化工股份有限公司；亚硝酸钠标准溶液：环保部标准物质研究所。

721型分光光度计：上海元析仪器有限公司；DF-2型集热式磁力加热搅拌器：金坛市医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 总黄酮提取

将荔枝壳用粉碎机粉碎后，取1.0 g荔枝壳粉末放入三口烧瓶中，加入乙醇提取液加热回流提取。提取结束后，将提取液冷却至室温25℃，抽滤、收集滤液并定容。采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定提取液中总黄酮含量[18]，并计算总黄酮得率。总黄酮得率的计算公式如下。

总黄酮得率Y/%=（XKV/W）×100

式中：X为提取液总黄酮浓度，mg/mL；K为提取液的稀释倍数；V为提取液体积，mL；W为荔枝壳粉末质量，g。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 料液比对总黄酮得率的影响

在提取温度50℃、提取时间120 min、乙醇体积分数60%的条件下，考察改变料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]对荔枝壳总黄酮得率的影响。

1.2.2.2 提取温度对总黄酮得率的影响

在料液比 1∶20（g/mL）、提取时间 120 min、乙醇体积分数60%的条件下，考察改变提取温度（20、35、50、65、80℃）对总黄酮得率的影响。

1.2.2.3 提取时间对总黄酮得率的影响

在料液比1∶20（g/mL）、提取温度50℃、乙醇体积分数60%的条件下，考察不同提取时间（50、85、120、155、190 min）对总黄酮得率的影响。

1.2.2.4 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

在料液比1∶20（g/mL）、提取温度50℃、提取时间120 min的条件下，考察不同乙醇体积分数（10%、20%、40%、60%、80%）对总黄酮得率的影响。

1.2.3 响应面试验设计

结合单因素试验结果，根据Box-Behnken设计原理[19]，采用响应面法进一步优化荔枝壳总黄酮提取工艺。试验数据采用Design-Expert 7.0.0软件以荔枝壳总黄酮得率为响应值进行分析。试验因素水平编码见表1。

表1 响应面法试验因素水平Table 1 Factors and levels for response surface methodology design

1.2.4 荔枝壳总黄酮抗氧化活性的测定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除试验方法按照文献[20]方法进行。用已知总黄酮浓度的荔枝壳提取液，准确配制6个不同质量浓度的样品溶液，分别取2.0 mL不同浓度的样品溶液于6只具塞比色管中，分别加入2.5 mL DPPH（0.1 mmol/L）甲醇溶液，混匀，避光反应30 min，测定吸光值AC（λ=517 nm）。同时用纯水、VC和BHT代替样品，按上述步骤，测得纯水空白对照的吸光值A0及Vc和BHT阳性对照的吸光值AC。DPPH自由基清除率计算公式如式（1）所示。

式中：A0为空白对照的吸光值；AC为样品或阳性对照品的吸光值。

1.2.4.2 总还原力的测定

总还原力采用普鲁士蓝法测定，具体操作按照文献[20]中方法进行。用已知总黄酮浓度的荔枝壳提取液，准确配制6个不同质量浓度的样品溶液，分别移取1.5 mL不同浓度的样品溶液于6只具塞比色管中，分别加入1.5 mL pH6.6的磷酸盐缓冲溶液和1.5 mL铁氰化钾（1%）溶液，混匀，在水浴锅中加热至50℃后水浴25 min，冷却后分别加入1 mL三氯乙酸溶液（10%），充分振荡，离心分离。取其上清液1 mL，加入1 mL三氯化铁溶液（0.1%）和2 mL纯水，混匀，静置10 min，在波长700 nm处测其吸光值。同时用VC和BHT代替样品，按上述步骤，测定不同浓度VC和BHT阳性对照的吸光值。

1.2.4.3 亚硝酸盐清除能力的测定

参考文献[21]的盐酸萘乙二胺法，并按HJ479—2017《环境空气氮氧化物的测定盐酸萘乙二胺分光光度法》改进了亚硝盐浓度的测定方法。分别移取一定量的荔枝壳提取液置于9个25 mL具塞比色管中（定容到 25 mL 时，总黄酮的浓度分别为 0、0.1、0.3、0.5、1、8、16、32、48 mg/L），分别加入 1.00 mL 浓度为 20 mg/L 的亚硝酸盐标准溶液和一定量的醋酸溶液，在30℃水浴加热30 min充分反应后，加入8 mL按HJ479—2017配制的显色液并定容到25 mL，显色后测定其吸光度。同时用VC和BHT代替样品，按上述步骤，测定不同浓度VC和BHT阳性对照的吸光度。亚硝酸盐清除率由公式（2）计算而得。

式中：A0为空白对照的吸光值；AC为样品或阳性对照品的吸光值。

1.2.4.4 超氧阴离子自由基清除能力的测定

试验方法参照文献[21]中的邻苯三酚自氧化法。分别移取不同质量浓度总黄酮的荔枝壳提取液1.0 mL置于10 mL试管中，加入5.00 mL浓度为0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2），充分混匀，在37℃恒温水浴10 min，取出后立即加入1 mL浓度为3.5 mmol/L的邻苯三酚溶液，迅速摇匀，再在37℃恒温水浴6 min，取出后加入1.0 mL浓度为8 mmol/L的HCl溶液终止反应，在320 nm测吸样品吸光度AC，用蒸馏水代替不同总黄酮质量浓度的荔枝壳乙醇提取液按上述步骤测定空白对照的吸光度A0。同时用VC和BHT代替样品，按上述步骤，测定不同浓度VC和BHT阳性对照的吸光度。超氧阴离子自由基清除率由公式（3）计算而得。

式中：A0为空白对照的吸光值；AC为样品或阳性对照品的吸光值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对荔枝壳总黄酮得率的影响

料液比对荔枝壳总黄酮得率的影响见图1。

图1 料液比对荔枝壳总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction yield of total flavonoids from litchi shell

由图 1可知，料液比在 1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL），荔枝壳总黄酮得率逐渐增加，继续增加溶剂量，荔枝壳总黄酮得率基本不变。这是由于增加溶剂可以增加荔枝壳细胞壁内外总黄酮的浓度差，有利于荔枝壳中总黄酮向乙醇溶液中转移。当进一步增加溶剂时，总黄酮在后处理浓缩过程中的损失增加，而导致总黄酮得率下降[22]。综合考虑，选择料液比1∶20（g/mL）进行后续试验。

2.1.2 提取温度对荔枝壳总黄酮得率的影响

提取温度对荔枝壳总黄酮得率的影响见图2。

由图2可知，温度为50℃时，荔枝壳总黄酮得率达到最大值为5.79%，继续升高温度，荔枝壳总黄酮得率略有下降。这是由于随着提取温度的升高（低于50℃），有助于增强乙醇对总黄酮的溶解能力，但当温度过高（高于50℃）时，提取的总黄酮会发生氧化而使其结构发生改变[23]，导致总黄酮得率下降。故选择提取温度50℃进行后续试验。

图2 提取温度对荔枝壳总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids from litchi shell

2.1.3 提取时间对荔枝壳总黄酮得率的影响

提取时间对荔枝壳总黄酮得率的影响见图3。

图3 提取时间对荔枝壳总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of total flavonoids from litchi shell

由图3可以看出，提取时间为50 min～120 min时，总黄酮得率逐渐上升，提取时间继续延长时（大于120 min），总黄酮得率逐渐下降。这是由于随着提取时间增加，提取液中总黄酮物质不断增加，但过长时间的加热提取可能使部分黄酮结构被破坏或发生其它副反应，进而导致总黄酮得率下降，这与文献[24]麻疯树籽总黄酮提取结果较一致。因此，选择提取时间120 min进行后续试验。

2.1.4 乙醇体积分数对荔枝壳总黄酮得率的影响

乙醇体积分数对荔枝壳总黄酮得率的影响见图4。

由图4可以看出，乙醇体积分数对荔枝壳总黄酮得率有较为明显的影响。当乙醇体积分数增加至60%时，总黄酮得率达到最大值为6.84%，但当继续增加乙醇体积分数时，总黄酮得率却不断下降。这可能是黄酮的溶解能力与溶剂的极性有关，溶剂的极性过大或过小都会导致荔枝壳总黄酮的溶解能力下降[25]，故总黄酮得率下降。因此，选择乙醇体积分数60%进行后续试验。

图4 乙醇体积分数对荔枝壳总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids from litchi shell

2.2 响应面法优化荔枝壳总黄酮提取工艺

2.2.1 二次响应面回归模型的建立与分析

响应面优化荔枝壳总黄酮提取试验结果如表2所示。

表2 响应面法试验方案和结果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental results

运用Design-Expert 7.0.0软件对数据进行回归拟合，求得荔枝壳总黄酮得率（Y）与料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和乙醇体积分数（D）的方程为：Y=6.71-9.167×10-3A+0.36B+0.10C-0.31D+0.11AB-0.077AC-0.67AD-0.15BC+0.80BD+0.37CD-0.38A2-0.075B2-0.26C2-0.97D2。

回归模型分析见表3。

表3 回归模型分析Table 3 The analysis results for regression model

从表3回归方程分析结果可知：该回归模型F=6.29，p=0.000 7<0.01，表明该试验所得的回归方程达到极显著水平，说明该模型具有较高的可信度，回归方程可以很好地对荔枝壳总黄酮得率进行预测。

从表3回归模型分析结果还可以看出，B的影响极显著，D的影响显著，由F值可知，各因素对荔枝壳总黄酮得率的影响大小顺序依次为B（提取温度）>D（乙醇体积分数）>C（提取时间）>A（料液比）；交互项AD和BD影响极显著，即料液比和乙醇体积分数、提取温度和乙醇体积分数的交互作用对荔枝壳总黄酮得率有极显著影响。

2.2.2 最佳工艺的预测和验证

用Design-Expert 7.0.0软件分析得到荔枝壳总黄酮最佳提取条件为：料液比1∶19（g/mL）、提取温度65℃，提取时间127 min，乙醇体积分数67.2%。在此条件下，荔枝壳总黄酮得率理论值为7.07%。实际操作过程中将提取条件修正为料液比1∶19（g/mL）、提取温度65℃，提取时间127 min，乙醇体积分数67%，实际测定的总黄酮得率为7.03%，与模型预测值相对误差为0.57%，说明回归模型对荔枝壳总黄酮得率预测结果准确可靠。

2.3 荔枝壳总黄酮抗氧化性分析

2.3.1 荔枝壳总黄酮对DPPH·的清除作用

荔枝壳总黄酮对DPPH·的清除作用见图5。

图5 荔枝壳总黄酮粗提液对DPPH·清除率Fig.5 Scavenging rate of total flavonoids from litchi shell on DPPH radicals

如图5所示，当荔枝壳总黄酮提取液质量浓度不断增加时，其对DPPH·的清除率也逐渐增加，当总黄酮提取液质量浓度为0.004 mg/mL时，DPPH·的清除率高达89%；对照品VC和BHT的质量浓度对DPPH·的清除率大小变化趋势与荔枝壳中总黄酮提取液的一致，当VC和BHT质量浓度均为0.032 mg/mL时，DPPH·的清除率分别为95%和71%。通过计算可知荔枝壳总黄酮提取液、VC和BHT对DPPH·的清除率与其质量浓度密切相关，其半抑制浓度（IC50）分别为0.002、0.014、0.025 mg/mL，比较总黄酮提取液、VC和BHT的IC50可知，对DPPH·的清除能力强弱顺序为：荔枝壳总黄酮提取液>VC>BHT，这说明荔枝壳总黄酮提取液对DPPH·有较强的清除能力。

2.3.2 荔枝壳总黄酮还原力

荔枝壳总黄酮还原力见图6。

从图6可以看出，随着荔枝壳总黄酮、对照品VC和BHT溶液质量浓度的增加，其显色溶液的吸光度均不断升高，且吸光度值和样品的还原力呈正线性相关[26]。在0.04 mg/mL～0.09 mg/mL浓度范围内，将样品质量浓度（X）和还原力Y进行拟合，荔枝壳总黄酮、VC和BHT的拟合方程为Y=12.20X+0.644（R2=0.975）、Y=6.157X+0.085（R2=0.969）和 Y=4.966X+0.065（R2=0.997），说明荔枝壳总黄酮、对照品VC和BHT质量浓度和其还原力之间均存在剂量依赖关系，且荔枝壳总黄酮还原力>VC还原力>BHT还原力。

图6 荔枝壳总黄酮提取液的还原力Fig.6 Reduction power of total flavonids from litchi shell

2.3.3 荔枝壳总黄酮对亚硝酸盐的清除作用

荔枝壳总黄酮对亚硝酸盐的清除作用见图7。

图7 荔枝壳总黄酮粗提液对亚硝酸盐的清除率Fig.7 Scavenging rate of total flavonoids from litchi shell on nitrite

由图7可知，随着荔枝壳总黄酮提取液、对照品VC和BHT质量浓度的增加，其对亚硝酸盐的清除率均先增加后再趋于平稳；质量浓度在0.1 mg/mL～8 mg/mL范围内，对清除能力大小顺序为：荔枝壳总黄酮>BHT>VC；随着质量浓度浓度的升高，VC对亚硝酸盐的清除效果越来越明显，在之后的16 mg/mL～48 mg/mL范围内，对亚硝酸盐清除能力大小顺序为：VC>荔枝壳总黄酮>BHT。当质量浓度为48 mg/mL时，荔枝壳总黄酮提取液、VC和BHT对亚硝酸盐的清除率分别为89%、92%和79%。说明荔枝壳总黄酮提取物对亚硝酸盐具有较强的清除能力。

2.3.4 荔枝壳总黄酮对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用

荔枝壳总黄酮对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用见图8。

图8 荔枝壳总黄酮粗提液对O2-·清除率Fig.8 Scavenging rate of total flavonoids from litchi shell on superoxide anion radicals

在测定的质量浓度范围内，荔枝壳总黄酮提取物对O2-·清除能力随着浓度增加而逐渐增强至平稳；其对O2-·清除率均高于同质量浓度的VC和BHT；当荔枝壳总黄酮提取物质量浓度为80 mg/L时，其清除率达到62%，表明荔枝壳总黄酮提取物对O2-·有较好的清除能力。

3 结论

乙醇提取荔枝壳总黄酮的最优提取工艺条件为料液比1∶19（g/mL）、提取温度65℃，提取时间 127min，乙醇体积分数67%，实际测定的总黄酮得率为7.03%，与模型预测值相对误差为0.57%。

荔枝壳总黄酮提取物具有较强的DPPH·、NO2-和O2-·清除能力，且在测定的质量浓度范围内，荔枝壳总黄酮提取物对DPPH·和O2-·的清除能力均强于对照品VC和BHT。此外，荔枝壳总黄酮提取物的还原力也强于DPPH·和O2-·。因此，荔枝壳具有较强的抗氧化能力。