ICP-MS 法同时测定辣木籽中22 种无机元素及主成分分析和聚类分析

牛延菲，曹红云，徐 怡，张晓南，吴春华

（1.西南林业大学化学与工程学院，云南昆明 650224；2.云南省药物研究所，云南昆明 650111）

辣木（Moringa oleiferaLam.）原产于印度及非洲的热带地区，为辣木科（Moringaceae）辣木属（MoringaAdans.）的植物，是一种多年生热带落叶乔木，19 世纪初引种至我国，目前广西、云南等地均有大面积种植[1]。辣木除栽培用于观赏外，还有广泛的食用和药用价值[2−4]，2012 年我国卫生部批准辣木叶为新资源食品。辣木籽为辣木的干燥成熟种子，种子近球形，除含有丰富的油脂、维生素、蛋白质等营养成分[5−7]，还含有黄酮类、酚苷类、多糖、维生素、生物碱、甾醇等多种活性物质[8−10]，具有抗氧化[11]、抗炎[12]、抗肿瘤[12]、降血糖血脂[13]、护肝[14]等药理作用，在食品、保健品、药品、医美等领域得到广泛研究和开发。

植物无机元素与其功效、营养价值密切相关，研究其无机元素含量与分布，对于阐明传统的药理、毒理，进一步开发药用资源具有重要的价值[15]。目前辣木籽研究大多针对其中化学成分的分离与鉴定，而对其无机元素的研究较少[16]，无机元素测定主要采用原子吸收光谱和电感耦合等离子发射光谱法，其中ICP-MS 法因其检出限低、精密度高、准确性好及同时分析多元素等优势，在食品、药学、化妆品等领域得到了广泛的应用[17]。本文建立了微波消解法和ICP-MS 内标法同时测定辣木籽（红河州元阳、红河州红河、红河州开远、楚雄州元谋、德宏州芒市、楚雄州双柏、昭通市巧家、昆明市东川、玉溪市元江、丽江市华坪10 个产地）中Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Ag、Cd、Sb、Ba、Hg、Tl、Pb22 种无机元素，同时从元素组学的角度建立无机元素特征图谱，并对数据进行主成分分析和聚类分析，以期探索辣木籽中无机元素的组成，为该植物的进一步研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣木籽 采集红河州元阳、红河州红河、红河州开远、楚雄州元谋、德宏州芒市、楚雄州双柏、昭通市巧家、昆明市东川、玉溪市元江、丽江市华坪10 个产地的样品，分别编号为S1～S10，由云南省药物所究所正高级工程师苏钛鉴定为辣木科辣木属植物辣木（Moringa oleiferaLam.）的干燥成熟种子；Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Ag、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb 单元素和混合标准溶液（1 mg/mL） 美国Agilent 公司；Hg、Au 单元素标准溶液（1 μg/mL） 国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院；Sc、Ge、In、Bi 混合标准溶液（1 mg/L） 美国Agilent 公司；Li、Y、Co、Bi 调谐液（1 mg/L） 美国Agilent 公司；硝酸 UPS 级，苏州晶瑞。

CEM Mars 6 高通量密闭微波消解仪 美国CEM 公司；Agilent 7700X 电感耦合等离子质谱仪 美国Agilent 公司；AG285 电子天平 梅特勒-托利多公司；Advantage 10 Milli-Q 超纯水发生器 美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的制备 精密量取多元素混合标准品适量，用10%硝酸进行稀释，配置成系列标准混合溶液，其中Na、Mg、K、Ca 和Fe 元素的质量浓度为8000、16000、24000、32000、40000 μg/L；Al、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se 和Mo 元素的质量浓度为80、160、240、320、400 μg/L；Ag、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb 和Hg 元素的质量浓度为8、16、24、32、40 μg/L。

1.2.2 内标溶液的制备 精密量取Sc、Ge、In 和Bi 混合标准溶液适量，用水分别稀释成1 μg/mL 的混合溶液，即得。

1.2.3 样品消解 称取本品粉末约0.3 g，置消解罐内，加优级纯硝酸8 mL，加入100 μL Au 单元素标准溶液（质量浓度：10 μg/L），混匀，过夜。置于高通量密闭微波消解仪内进行消解，消解程序为：功率900 W，以5 ℃/min 速率自室温加热至90 ℃，保持10 min；功率1800 W，以3 ℃/min 速率加热至125 ℃，保持15 min；以100%的功率，以3 ℃/min 速率加热至180 ℃，保持30 min。待消解结束，冷却，放气，药液由消解罐转移至50 mL 量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。使用同法制备空白溶液。

1.2.4 仪器条件 使用浓度为1 mg/L 的调谐液Li、Y、Co、Bi 调谐，使ICP-MS 的各项参数均达到要求，即仪器射频的功率为1500～1700 W、等离子体气流速15.0 L/min、辅助气的流速1.0 L/min、载气的流速为0.8～1.1 L/min、耐盐型雾化器温度2 ℃、蠕动泵稳定时间35 s。

1.2.5 测定法 测定时选取的同位素为23Na、24Mg、27Al、39K、40Ca、52Cr、55Mn、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、78Se、95Mo、107Ag、111Cd、121Sb、137Ba、202Hg、205Tl 和208Pb，其 中23Na、24Mg、27Al、39K、40Ca、52Cr、55Mn 和56Fe，以45Sc 作为内标；59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As 和78Se，以72Ge 作为内标；95Mo、107Ag、111Cd、121Sb 和137Ba，以115In 作为内标；202Hg、205Tl 和208Pb，以209Bi 作为内标。以各元素与内标元素计数值的比率值为纵坐标，元素质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，从标曲计算得各元素相应的浓度，同时扣除空白溶液的干扰。

1.3 数据处理

本研究利用Excel 2010、SPSS 22.0 软件进行了数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 线性关系考察 取“1.2.1”项下多元素系列标准混合溶液，在“1.2.4”仪器条件下进行测定，以10%硝酸溶液为空白，依次测定，以多元素的质量浓度（μg/L）为横坐标、待测元素与内标溶液检测器响应值比值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。由表1 可见，Na、Mg、K、Ca、Fe 元素在0～40000 μg/L；Al、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo 元素的质量浓度为0～400 μg/L；Ag、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb、Hg 元素的质量浓度为0～40 μg/L 范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.999。

2.1.2 检出限实验 将空白溶液在“1.2.4”条件下连续测定11 次，以测定结果的3 倍标准偏差所对应的浓度值为22 种元素的仪器检出限，结果见表1 检出限在0.04～78.44 μg/L，满足分析要求。

2.1.3 精密度试验 取配制好的混合对照品溶液（Na、Mg、K、Ca、Fe 元素的质量浓度为16000 μg/L；Al、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo 元素的质量浓度为80 μg/L；Ag、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb、Hg 元素的质量浓度为24 μg/L），在“1.2.4”仪器条件下进行测定，连续测定7 针，RSD 值均小于5.0%，表明本法具有良好的精密度。

2.1.4 重复性试验 精密称取同一批号的样品6 份，按照“1.2.3”前处理，在“1.2.4”仪器条件下进行测定。经计算，检出限以上元素的含量RSD%均小于5.0%，结果表明本法具有良好的重复性。

2.1.5 准确度试验 精密称取已知含量的样品0.3 g，平行制备6 份，分别加入适量的标准溶液，按照“1.2.3”项下方法前处理，在“1.2.4”仪器条件下进行测定，计算回收率，结果见表2。经计算22 种无机元素的回收率在80.13%～113.66%之间，RSD<10%，符合规定。

2.1.6 样品测定 取10 个产地样品，按照“1.2.3”项下方法前处理，在“1.2.4”仪器条件测定，结果见表3。根据结果分析，辣木籽中无机元素种类丰富，其中K、Mg、Ca、Zn、Fe、Na、Mn 等元素含量较高，尤以K、Mg 和Ca 含量最高，这提示辣木籽可作为补充K、Mg 和Ca 元素的食物来源。同时所采集的10 个不同产地的辣木籽As、Cd、Sb、Hg、Tl、Pb 有害元素含量较低，说明辣木籽中上述有害元素污染风险较低。

2.2 辣木籽无机元素指纹图谱建立

表3 中含量数据表明，不同产地辣木籽均含有丰富的K、Mg、Ca 人体必需常量元素（>1000 mg/kg）；较高的Fe、Zn、Mn、微量元素（>10 mg/kg）；较低的As、Cd、Sb、Hg、Tl、Pb 有害元素（<0.2 ppm）。根据表3 辣木籽22 种无机元素含量测定结果，按照无机元素原子序号的顺序绘制含量分布曲线，为便于同时呈现所有元素，参考相关文献[17]把含量悬殊的元素缩小相同倍数（K、Mg、Ca 含量各缩小10 倍），详见图1。由元素指纹图谱可见，10 个产地样品中无机元素指纹图谱具有相似的峰形，即各无机元素含量按原子序号顺序在一定程度上呈现出有规律的高低分布，生成的共性无机元素谱可用于鉴别辣木籽。

2.3 主成分分析

剔除未检出的元素，将14 种元素（Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、Se、Mo、Ba）含量测定结果用SPSS 22.0 统计学软件进行主成分分析，得到各主成分特征值、贡献率及累积贡献率（见表4），由结果可知，前4 个主成分的特征值均大于1，分别为4.66、3.22、2.26、1.19，对总方差的累积贡献率达80.94%，能够反映出大部分信息，故选择前4 个成分进行分析。

表1 22 种元素回归方程Table 1 Regression equation of 22 elements

表2 准确度试验测定结果（n=6）Table 2 Accuracy measurement results (n=6)

旋转成分矩阵图见表5，其中第1 个主成分与Zn、Ca、Cu 呈正相关（相关系数均>0.8），第2 个主成分与Fe 呈正相关，第3 个主成分与Cr 呈正相关（相关系数>0.7），第4 个主成分与Ba、Al 呈正相关（相关系数>0.8），并且第1、第2、第3、第4 个主成分的累计方差贡献率为80.94%，超过总方差的80%，所以推断Zn、Ca、Cu、Fe、Cr、Ba、Al 是辣木籽的特征无机元素。

2.4 聚类分析

使用SPSS 22.0 统计学软件，采用组间联接方法、系统聚类分析法对10 批辣木籽样品中22 种无机元素含量进行聚类分析，当欧式距离平方和为5 时，10 个样品可分为两大类，结果见图2。其中，S5（德宏州芒市）单独聚为一类，其余样品为一类。对其余样品进行细分，S4（楚雄州元谋）、S6（楚雄州双柏）、S7（昭通市巧家）、S8（昆明市东川）、S10（丽江市华坪）可聚为一类，上述5 个产地均为金沙江干热河谷区域；S2（红河州红河）、S3（红河州开远）、S9（玉溪市元江）可聚为一类，上述3 个产地均为红河（元江）干热河谷区域。聚类分析的结果表明，辣木籽无机元素的含量与环境、地域等因素具有相关性。

3 结论与讨论

本研究开发建立了密闭微波消解、ICP-MS 内标法同时测定辣木籽中的Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Ag、Cd、Sb、Ba、Hg、Tl、Pb22 种无机元素的检测方法。其中，为排除Hg 元素的记忆和吸附效应，加入Au 元素成功抑制该效应；同时采用内标补偿法[17]，排除基体效应对多元素产生的抑制作用；最后，通过方法学验证了该方法的准确性和可靠性。结果表明，本方法中的22 种元素的方程系数均大于0.999，仪器精密度RSD 均在5%以内，加样回收率在80.13%～113.66%之间，方法简便、准确、可行。

表3 样品测定结果（mg/kg，n=3）Table 3 Test results of samples (mg/kg,n=3)

图1 无机元素指纹图谱Fig.1 Fingerprint of inorganic elements

表4 各主成分特征值、贡献率及累积贡献率Table 4 The characteristic value,contribution rate and cumulative contribution rate of each principal component

表5 旋转成分矩阵Table 5 Rotating component matrix

无机元素尤其是某些微量元素在中药材发挥药效的过程中也具有重要的作用[18−19]。本研究中采用ICP-MS 法对辣木籽中22 种无机元素的含量进行测定，结果显示，10 个产地的辣木籽中含有较丰富K、Mg、Ca、Na 人体必须的常量元素；较高的Fe、Zn、Mn、Cu 微量元素；检出Al、Ni、Cr、Mo、Co 微量元素；很低的As、Cd、Sb、Hg、Tl、Pb 重金属及有害元素。符合《中国药典》四部（2020 年版）9302“中药有害残留物限量制定指导原则”中规定的重金属及有害元素一致性限量指导值：药材及饮片（植物类）Pb 不得超过5 mg/kg，Cd 不得超过1 mg/kg，As 不得超过2 mg/kg，Hg 不得超过0.2 mg/kg。

图2 辣木籽聚类分析结果Fig.2 The cluster analysis results

综合分析辣木籽无机元素指纹图谱，云南10 个产地的辣木籽中含有较丰富K、Mg、Ca、Na 人体必须的常量元素；较高的Fe、Zn、Mn、Cu 微量元素；且均呈高钾低钠特征。K 有助于增强心脏动力、降低血压，高钾低钠食物可促使钠盐排泄，调整细胞内钾钠的比值，有益于高血压防治[20]；Mg 是酶反应的重要配体之一，具有舒张血管而使血压下降的作用，缺乏时导致细胞内外的渗透压平衡被破坏，引起高血压和其它病变；Ca 是构成骨骼及牙齿的主要成分，还有抗炎、消肿等作用[21]；Fe 在人体内主要参与氧的运输和造血过程，保持细胞的正常功能；Cu 参与铁的代谢和红细胞生成，维持中枢神经系统的正常功能[22]；体内缺乏Zn 影响人体的衰老；Mn 是超氧化物歧化酶的活性组分，改善脂质代谢，维持血糖、血脂和血压水平，对急性心肌缺血具有保护作用[23]。ICP-MS 作为一种准确、便捷的技术手段可用于药材的有害重金属元素[24−26]、有益微量元素[27]的质量控制，不同产地辣木籽所含的无机元素与辣木籽具有治疗心脑血管疾病、抗氧化等作用是相符合的[28−30]。本研究结果为进一步揭示辣木籽中富含的有益微量元素与治疗心血管疾病的关系提供了有利数据。