响应面法优化菊黄东方鲀肌肉多肽制备工艺

屈帅杰，刘淑集，苏永昌，潘 南，廖登远，许 旻，王 勤,，刘智禹,

（1.厦门大学生命科学学院，福建厦门 361000；2.福建省水产研究所，国家海水鱼类加工技术研发分中心（厦门），福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建厦门 361013）

菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）是河豚鱼的一种，鱼身无鳞片，其形体呈椭圆形状[1]，在中国渤海、黄海和东海等海域均有分布，为温带地区近海底层鱼类[2]。菊黄东方鲀肌肉富含蛋白质、必需氨基酸，属于高质量蛋白质食物来源[3]。近年来，菊黄东方鲀的育苗养殖技术日渐成熟，已成为我国四大养殖河豚鱼品种之一，相对于野生的菊黄东方鲀，养殖的菊黄东方鲀的毒性大大降低，且其毒性主要存在于内脏之中，菊黄东方鲀的肌肉是无毒的[4]。随着菊黄东方鲀养殖产量不断增加，科研人员对于菊黄东方鲀的研究及产品开发不断深入。

从海洋生物中制备的多肽具有抗疲劳、抗氧化、提高免疫力、降血压和降血糖等功效[5−11]。Kondo等[12]发现鲭鱼肽可以抑制低密度的脂蛋白（LDL）的氧化，Jang 等[13]在红海鞘（Halocynthia aurantium）的血细胞中纯化出抗菌肽Halocidin，卢连华等[14]研究海参肽对小鼠抗疲劳能力的影响发现，海参肽可以显著提高小鼠负重游泳的时间，并使运动后的小鼠血液中的乳酸和尿素氮含量明显下降。常见的多肽制备的方法有直接提取法、微生物发酵法、酶解法、基因重组法等。直接提取法是直接将生物体内的活性肽提取出来。这种方法主要针对的是生物体内已经存在的活性肽[15]。因为生物体中活性肽较少，且生物体内的物质比较复杂，如果想得到高纯度的活性肽，则必须经过极为繁琐的分离纯化和精炼的步骤，这将导致制备成本的加大。微生物发酵法成本低廉，且微生物会产生多种酶，其中有的蛋白酶可以有效地将发酵原料中的苦味肽、腥味物质以及少量的脂肪分解，改善其风味，但该方法制备多肽同时也具有一定安全隐患，比如一些产菌菌株具有毒害性[16]。由于基因重组法制备多肽的成本较高，所以该方法也难以应用于工业生产。而酶法提取具有诸多优点，比如条件温和，能让多肽产品具有较高的速溶性、耐热、耐酸、稳定性好等优点[17−18]。

响应面法是一种常用的试验优化方法，该法已应用于多种优化实践中[19−21]。本实验采用酶解法制备菊黄东方鲀肌肉多肽，并以蛋白水解度作为该试验的响应指标，利用响应面法优化制备工艺，为菊黄东方鲀肌肉多肽的开发利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菊黄东方鲀 福建省鲀之鲜水产有限公司；酸性蛋白酶（50 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（200 U/mg）、风味蛋白酶 （30 U/mg）、木瓜蛋白酶（100 U/mg） 索莱宝生物科技有限公司；胰蛋白酶（50 U/mg）、无水乙醇（分析纯）、茚三酮（分析纯）、十二水和磷酸二氢钠（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；果糖 分析纯，阿拉丁试剂有限公司。

Infinite M200 Pro 酶标仪 TECAN 集团有限公司；Digestor 2508 消化炉 丹麦福斯公司；KjeltelTM8400 凯氏定氮仪 丹麦福斯公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菊黄东方鲀肌肉多肽制备 去除菊黄东方鲀的头部、鱼皮、血液、骨头，保留肌肉部分。用水清洗干净之后，用绞肉机将肌肉绞碎成鱼糜。采用凯氏定氮仪检测肌肉蛋白质的含量，参考GB 5009.5-2016。然后在适宜的温度、pH、加酶量、料液比、反应时间进行酶解实验。酶解完成后将酶解液煮沸10 min，将蛋白酶进行灭活，检测酶解液的水解度。

1.2.2 蛋白酶的筛选 分别采用胰蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶进行酶解实验。设定6 种酶的反应条件，即料液比（1:10）、反应时间（8 h）、加酶量（5000 U/g)。各种酶对应的pH 和温度如表1 所示[22]。酶解8 h之后，100℃水对蛋白酶进行灭活，时间为10 min，冷却后10000 r/min 离心10 min，保留上清液测定水解度。

表1 不同蛋白酶最适的pH 和温度Table 1 Optimal pH and temperature of different proteases

1.2.3 水解度的测定 采用茚三酮法[23]对上述酶解液进行水解度的测定，计算公式如下：

式中：h 表示酶解1 g 蛋白质所裂解的肽键的量（mmol）；htot表示每1 g 酶解物中的蛋白质的肽键的量（mmol），河豚肉取7.70 mmol/g。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 pH 对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度的影响 固定反应时间5 h，料液比为1:10（g/ mL）、温度50 ℃，酶添加量为5000 U/g，pH 分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，以水解度（DH）为指标，考察pH 对菊黄东方鲀肌肉酶解液水解度的影响。

1.2.4.2 酶解时间对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度的影响 固定反应所需的pH 为7.0，料液比为1:10（g/mL）、温度50 ℃，加酶量为5000 U/g，反应时间分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，以水解度（DH）为指标，考察反应时间与水解度的关系。

1.2.4.3 料液比对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度的影响 固定反应pH 为7.0，反应时间5 h，反应温度50 ℃，酶添加量为5000 U/g，料液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25（g/mL），以水解度（DH）为指标，考察料液比与水解度的关系。

1.2.4.4 反应温度对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度的影响 固定反应pH 为7.0，反应时间5 h，料液比为1:10（g/mL）、酶添加量为5000 U/g，反应温度分别为30、40、50、60、70 ℃，以水解度（DH）为指标，考察反应温度与水解度的关系。

1.2.4.5 加酶量对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度的影响 固定反应pH 为7.0，反应时间5 h，料液比为1:10（g/mL），反应温度50 ℃，酶添加量分别为1000、2000、3000、4000、5000 U/g，以水解度（DH）为指标，考察加酶量与水解度的关系。

1.2.5 响应面法优化酶法制备菊黄东方鲀肌肉多肽的工艺条件 根据单因素实验得出的结果，选择对水解度影响较大的pH、加酶量、反应温度3 个因素为考察对象进行Box-Behnken 设计，以水解度为指标，优化菊黄东方鲀肌肉多肽的最优酶解工艺，表2 为各因素的水平表，反应时间为5 h，料液比为1:10（g/mL）。

表2 Box-Behnken 设计因素水平设计Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 数据处理

实验结果以平均值±标准差（X±SD）的方式表示，每组实验重复三次，并用Origin8.5 软件作图。Design Expert 8.0 设计响应面试验，并对实验数据进行方差分析及二次多项式回归拟合。

2 结果与分析

2.1 菊黄东方鲀肌肉总粗蛋白的含量

菊黄东方鲀肌肉总粗蛋白的含量为19.06%±0.080%。关于河豚鱼的蛋白质含量已经有大量研究，高露姣等[24]检测到不同饲养条件下的红鳍东鲀肌肉的粗蛋白含量在15.88%～17.22%，刘振熙等[25]检测到黑鳃兔头鲀肌肉（Lagocephalus laevigatus）蛋白质含量为18.70%。相对于其他品种的河豚鱼，菊黄东方鲀肌肉蛋白质含量略高。

2.2 蛋白酶的筛选

如图1 所示，在一定条件下，酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶对菊黄东方鲀肌肉蛋白的酶解水平是具有一定差异的，其水解能力排序为风味蛋白酶>中性蛋白酶>碱性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胰蛋白酶>酸性蛋白酶。风味蛋白酶酶解菊黄东方鲀肌肉的水解水解能力最强，其水解度值为22.38%。水解度越高表示蛋白质酶解得越彻底，酶解产物中的多肽的种类和功能也越丰富，所以选择风味蛋白酶进行后续实验。

图1 不同种类的蛋白酶的酶解效果Fig.1 Enzymolysis effect of different kinds of protease

2.3 单因素实验结果

2.3.1 反应体系 pH 的确定 pH 的大小直接影响风味蛋白酶酶解菊黄东方鲀肌肉蛋白过程中的酶活力。如图2 所示，pH 在6.0～7.5 的范围内，菊黄东方鲀肌肉蛋白的水解度是随着pH 上升而上升的，而后菊黄东方鲀肌肉蛋白的水解度随着pH 的上升而下降。菊黄东方鲀肌肉蛋白在pH 在6.0 和8.0 的条件下酶解，酶解液的水解度较低，该现象可能是因为风味蛋白酶在pH 为6.0 和8.0 的反应体系中其自身的酶活受到抑制，导致催化效果的降低。而pH 在7.5 的时候，风味蛋白酶的酶活性相对较高，因此酶解pH 选取7.5 为宜。

图2 pH 对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of different pH on protein hydrolysis of the muscle from Takifugu flavidus

2.3.2 反应体系时间的确定 酶解时间对于酶解实验至关重要，如果酶解时间较短，底物酶解不充分，就会导致水解度降低。如图3 所示，当反应时间从3.0 h逐渐延长到5.0 h 时，菊黄东方鲀肌肉蛋白的水解度呈现逐渐上升的趋势，4.5 h 后水解度基本稳定下来,可能是酶解进行到4.5 h 之后已经达到了饱和状态。从缩短生产周期的角度考虑，酶解时间选取4.5 h为宜。

图3 酶解时间对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of different enzymatichydrolysis time on protein hydrolysis of the muscle from Takifugu flavidus

2.3.3 反应体系料液比的确定 料液比在酶解反应过程中起到关键性作用。适宜的料液比有利于提高传质推动力，有利于酶解实验的进行。由图4 可知，随着料液比（g/mL）的降低，菊黄东方鲀肌肉蛋白的水解度呈先上升后下降的趋势，在料液比1:5 时，酶解液的水解度较低。料液比为1:10 时，水解度达到最高水平，之后随着溶剂的增加，水解度趋于稳定，因此酶解料液比选取1:10为宜。

图4 料液比对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of different feed-liquid ratios on protein hydrolysis of Takifugu flavidus

2.3.4 反应体系温度的确定 反应温度的高低对酶活力具有直接的影响，反应温度太低或太高均降低风味蛋白酶的酶活力。如图5 所示，温度在30～60 ℃的范围内，菊黄东方鲀肌肉蛋白的水解度是随着反应温度的上升而上升的，而后当反应温度继续上升时，水解度开始下降。反应温度增高，提高了分子撞击的机率，从而对酶催化效率有促进作用，所以菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度逐渐增大。当反应温度持续增高，酶的活性逐渐下降，黄东方肌肉蛋白水解度也随之降低[26]，因此酶解温度选取60 ℃为宜。

图5 反应温度对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度的影响Fig.5 Effects of reaction temperature on protein hydrolysis of the muscle from Takifugu flavidus

2.3.5 反应体系加酶量的确定 酶反应底物的水解程度直接取决于所加酶量的多少[27]，如图6 所示，在酶添加量处在1000～4000 U/g 的区间时，菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度随酶添加量的增加呈现出了上升的趋势，而后，酶添加量继续增大时，菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度逐渐平稳。出于对生产中成本核算的考虑，选取加酶量4000 U/g 为宜。

2.4 响应面试验

2.4.1 响应面试验结果 根据单因素实验的结果，进行3 因素3 水平响应面试验，结果如表3 所示，对数据的方差分析结果见表4。根据Box-Behnken 的组合设计原理，采用Design-Expert8.0 软件设计3 因素3 水平共17 个实验，其中中心点重复5 次实验，以水解度作为响应值（DH，%），具体实验设计方案与结果见表3。对表3 数据进行多元二次回归拟合，建立制备工艺参数回归模型。回归方程为：

2.4.2 响应面回归模型方差分析 由表4 可知，二次回归模型的F值为31.36，P<0.0001，表明模型达到了极显著水平；失拟项是模型中数据的变异，失拟项P=0.5450>0.05，说明失拟项差异不显著，试验没有失拟因素，所以可以充分地反映实际情况，因此可以断定回归模型是适合的；且该试验模型的决定系数R2=97.58%，表明实际结果与模型预测结果一致性较强，试验模型的校正系数R2Adj=94.47%，试验结果有94.47%受试验因素的影响。因此，结果可靠，此模型可以对菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度结果进行分析和预测。回归方程各项方差分析中F检验可以判断自变量对因变量的影响，由此得到各因素对水解度影响的主次顺序为C>B>A，所以对菊黄东方鲀肌肉蛋白的水解度影响最大的是反应温度，然后是加酶量，最后是pH。由回归方程和方差分析还可知，模型中一次项B、C、对水解度的影响达到极显著水平（P<0.01），A 对水解度的影响达到显著水平（P<0.05）；模型中二次项B2对水解度的影响达到极显著水平（P<0.01），A2对水解度的影响达到显著水平（P<0.05）。

表3 Box-Behnken 试验方案及结果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

2.4.3 优化与验证 根据所得的模型，进一步确定各因素最佳条件，得优化的制备条件。以水解度作为指标，菊黄东方鲀肌肉多肽的最佳制备工艺为：加酶（风味蛋白酶）量4521.96 U/g、反应温度55 ℃、酶解pH7、料液比1:10（g/mL）、反应时间4.5 h，蛋白质水解度的预测值为26.66%。为检验试验结果与真实情况的一致性和可靠性，进行验证试验，水解度达到最大值为26.26%，相对误差为1.48%。所以，响应面法优化所得的最佳工艺条件有比较好的实际应用价值。

3 讨论与结论

海洋生物多肽的生物功效已被大量的实验研究所证明，本论文对于菊黄东方鲀肌肉多肽酶解工艺的研究对于海洋生物资源的开发具有一定推动作用。本实验采用响应面法进行酶解工艺的优化，并且最终确定了最佳酶解条件，为后续的工业化生产提供一定参考。但由于该实验工作量较大，导致实验周期较长，实验系统误差较大，最终导致相同条件下的酶解实验结果存在一定差异的现象。这一不足还有待后续的实验进一步改进。

根据实验分析，以标的酶的筛选和单因素实验作为基础，通过Box-Behnken 响应面试验设计确定制备菊黄东方鲀多肽最佳制备工艺为：加酶量4521.96 U/g、酶解温度55 ℃、酶解pH7、料液比1:10（g/mL）、酶解时间4.5 h，在此条件下，重复验证实验得菊黄东方鲀肌肉蛋白水解度最大值为26.26%，相对预测值误差为1.48%。证明应用响应面法优化菊黄东方鲀多肽的制备是准确可行的，实验结果为菊黄东方鲀多肽的进一步研究和工业化生产提供一定理论依据。