不同贮藏温度下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长预测模型的建立

陈 雨，梁 莹，周萍萍，任建鸾，杨捷琳，郭德华，薛 峰,，蒋 原,，汤 芳，戴建君,4

（1.南京农业大学，动物健康与食品安全国际合作实验室，江苏南京 210095；2.国家食品安全风险评估中心，北京 100022；3.上海海关动植物与食品检测中心，上海 200135；4.中国药科大学，江苏南京 211199）

大肠杆菌（Escherichia coli）是属肠杆菌科的杆状革兰氏阴性食源性病原菌，大肠杆菌O157:H7 是肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC）中最常见的血清型，它的重要宿主是牛[1]，可通过饮用受污染的水或进食未熟透的食物传染给人类[2]，主要栖息在包括人类在内的温血动物的下肠道，经常被用作评估水质和食品的粪便污染指示细菌[3]，能够在恶劣的环境条件下和冷藏温度下生存，在许多国家都引发了严重的食源性疾病[4−6]，全球每年由于食源性或水源性腹泻导致约220 万人死亡，由大肠杆菌所引起的疾病严重危害着人们的身体健康，已经成为了最重要的世界性卫生疾病问题之一[7]。

生牛肉中含有丰富的营养物质，随着我国居民生活水平不断提高，人们对于牛肉营养丰富意识加深，结合非洲猪瘟爆发以来，更多人选择牛肉来代替猪肉食用，然而受饲养周期长、饲养成本高等因素影响，国内牛肉产量远不能满足居民消费需求，进口牛肉口感好营养丰富价格低，所以我国长期依靠大量进口来弥补国内牛肉产需缺口。但是进口生鲜牛肉可能的污染途径较多，在肉牛养殖环节、屠宰加工环节、运输环节、营销环节，若存放和贮藏方式不当，都可能造成牛肉表面微生物生长繁殖[8]，引起肉品腐败变质，更有可能引起食源性疾患，按进食场所统计，家庭是食源性疾病发生的主要场所占61.2%[9]，近些年的监测数据表明，我国牛肉中检测出肠出血性大肠杆菌的几率可达到4.46%[10−12]，我国市售生肉中存在一定程度的大肠杆菌O157:H7 的污染[13−15]，许多国家在评估生鲜肉安全性时都对大肠杆菌进行标准限量的规定，这说明大肠杆菌在生鲜肉中的重要性，人们越来越重视进口生鲜食品的食用安全问题，所以研究进口生鲜牛肉上微生物的生长规律对于保障生鲜牛肉、乃至食品安全都十分必要。

预测微生物学是建立于微生物生长学、数学模型、统计学和计算机基础上模拟和预测在特定条件下食品微生物的生长和存活的模型的一种新兴学科[16]，依据食源性微生物在不同关键环节中的特征性数据，它能够通过计算机来进行分析以及处理，建立温度、pH、水分活度等各种环境因素与食源性微生物之间关系的数学模型，从而对快速评估食品安全和预测提高卫生检验效率[17−18]。

本实验以生鲜牛肉为原料，分别测定在4、16、25、30、37 ℃储藏条件下大肠杆菌的生长数据分别采用Modified Gompertz 模型、Logistic 模型、Richards模型和MMF 模型构建恒定温度下生鲜牛肉中大肠杆菌的生长动力学一级模型，另建立二级模型以描述温度与最大比生长速率（μmax）和迟滞期（λ）的关系并检验预测模型的准确性，以期为进口生鲜牛肉的定量风险评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌O157:H7（NCTC12900） 南京农业大学人兽共患病实验室；结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；进口生鲜牛肉 北京华联超市。

BJPX-150 生化培养箱美国 Thermo Fisher 公司；ZQZY-AS8 振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；BagMixer400SW 拍击式匀质器 法国Interscienc公司；SW-CJ-2FD 超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；GR60DA 立式自动压力蒸汽灭菌器 致微（厦门）仪器有限公司；SQP 电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 悬菌液的制备 将大肠杆菌在VRBA 平板划线培养18 h，挑取单个菌落于LB 液体培养基中，置于摇床中，37 ℃、180 r/min 培养18 h，测定菌液浓度（约107～108cfu/mL），再将菌液用1×PBS 缓冲液稀释成浓度为104cfu/mL 的悬菌液，备用。

1.2.2 灭菌进口生鲜牛肉的制备 将从超市2 h 内新鲜购买的进口生鲜牛肉平铺放置于无菌操作台中，开启紫外光照射20 min 后，用无菌镊子翻动牛肉至另一面，继续用紫外光照射20 min。将生牛肉浸入无菌水中处理1 min，用无菌镊子取出牛肉，使用无菌手术刀将灭菌牛肉切成块状（质量约10 g）。

1.2.3 大肠杆菌的接种、培养和计数 将生牛肉放入上述已制备好的大肠杆菌菌悬液中浸泡1 min，每份牛肉均混合均匀后取出沥去多余水分，使牛肉的细菌接种量约为103cfu/g，将处理好的牛肉分装于匀质袋中，分别置于4、16、25、30、37 ℃恒温培养箱中培养。为了保证实验的准确性，在每个温度下设3 组平行试验，每组平行试验在每个取样点设3 个重复样品。每隔一定的时间，将实验牛肉块放置到匀质袋中，并加入90 mL 1×PBS 缓冲液，用拍击式匀质器拍打5 min；用1×PBS 缓冲液经适当的倍比稀释后，取0.1 mL 菌悬液在VRBA 大肠杆菌计数培养基上进行涂布，将涂布后的培养基放置于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h，用平板计数法计算大肠杆菌数量。

1.2.4 一级模型的建立 利用Origin2019b 软件，将在不同温度下进口生鲜牛肉中测得的大肠杆菌生长数据，用Modified Gompertz、Logistic、Richards、MMF 4 种模型进行拟合，对4 种模型相关系数进行比较，选择出最适合的模型。4 种模型的方程表达式见式（1）：

Modified Gompertz 模型：

式中：N0表示0 时的菌数量，即初始菌数量lg（cfu/g）；Nt表示t 时的菌数量lg（cfu/g）；t 表示生长时间（h）；exp 表示返回e 的n 次方，e 是一个常数为2.71828；a、b、c 表示模型参数。

Logistic 模型：

式中：N0表示0 时的菌数量，即初始菌数量lg（cfu/g）；Nt 表示t 时的菌数量lg（cfu/g）；t 表示生长时间（h）；exp 表示返回e 的n 次方，e 是一个常数为2.71828；a、b、c 表示模型参数。

Richards 模型：

式中：N0表示0 时的菌数量，即初始菌数量lg（cfu/g）；Nt 表示t 时的菌数量lg（cfu/g）；t 表示生长时间（h）；exp 表示返回e 的n 次方，e 是一个常数为2.71828；a、b、c、d 表示模型参数。

MMF 模型：

式中：N0表示0 时的菌数量，即初始菌数量lg（cfu/g）；Nt 表示t 时的菌数量lg（cfu/g）；t 表示生长时间（h）；a、b、c、d 表示模型参数。

根据一级模型所得模型参数可计算大肠杆菌在进口生鲜牛肉中最大比生长速率（μmax）和延滞期（λ）：

式中：μmax表示细菌最大比生长速率（h−1）；λ 表示细菌生长迟滞期持续时间（h）；a、b、c 表示模型参数。

1.2.5 二级模型的建立 根据一级模型得到的最大比生长速率（μmax）和延滞期（λ）与温度的关系，选取Ratkowsky 提出的经典的平方根方程[19]建立二级模型，方程式如下：

式中：μmax表示细菌最大比生长速率（h−1）；λ 表示细菌生长迟滞期持续时间（h）；T 为实验设置的生长温度（℃）；Tmin为假设大肠杆菌O157:H7 生长速率为零时的温度（℃）；b 为回归参数。

1.2.6 模型检验 本试验采用准确因子（Accuracy factor，Af）、偏差因子（Bias factor，Bf）及均方根误差（RMSE）对所得模型的可靠性进行检验。

式中：μobs表示根据细菌计数所得观测值；μpred表示根据模型计算所得预测值；n 表示实验次数；均方根误差（RMSE）表示实验观测值和模型预测值之间的差距，RMSE 越小，说明模型拟合效果越好；准确因子（Af）表明预测值周围的分布情况，Af越接近1，说明模型越准确；偏差因子（Bf）表明细菌生长预测值和观测值的相对平均偏差，Bf越接近1，说明模型越准确。

1.3 数据处理

每组实验重复3 次，取平均值。用Excel 进行数据记录以及统计分析，利用Origin 2019b 进行模型拟合。

2 结果与分析

2.1 不同温度下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长变化

温度是影响环境中大肠杆菌存活和生长的重要因素，大肠杆菌可以在最佳生长条件36～40 ℃下快速生长[20]，Whitman 等[21]的研究表明大肠杆菌可在4 ℃的密封塑料袋中储存的晒干藻垫中存活了6 个月以上。由图1 可知，4 ℃贮藏条件下，进口生鲜牛肉中大肠杆菌数量随着贮藏时间的延长而小幅度增加，大肠杆菌在4 ℃条件下能较好地存活，说明它是一种耐冷性细菌，在16～37 ℃贮藏条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长较好，随着温度逐渐升高到37 ℃，大肠杆菌生长速率逐渐增加达到稳定期和最大菌量时所用时间均减少。结果表明温度对大肠杆菌的生长具有较大影响，说明进口生鲜牛肉在屠宰加工环节、运输环节、营销环节对于温度严格控制十分重要。

图1 不同温度下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长曲线Fig.1 Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at different temperatures

2.2 一级模型的建立

将大肠杆菌在不同恒定温度下的实验数据导入Origin 2019b 软件，利用Modified Gompertz、Logistic、Richards、MMF 4 种模型求得的预测结果，得到了在4、16、25、30、37 ℃条件下实测和拟合曲线可以看出大肠杆菌在不同温度下的生长趋势，如图2～图5 所示，分别利用Modified Gompertz、Logistic、Richards、MMF 4 种模型得到的拟合曲线与实测值曲线吻合程度较高，可以初步判断四种模型能较好的拟合进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长动态。

图2 Modified Gompertz 模型拟合的 4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线Fig.2 Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4,16,25,30 and 37 ℃ fitted by modified Gompertz model

图3 Logistic 模型拟合的4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线Fig.3 Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4,16,25,30,37 ℃ fitted by Logistic model

图4 MMF 模型拟合的4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线Fig.4 Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4,16,25,30,37 ℃ fitted by MMF model

图5 Richards 模型拟合的4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线Fig.5 Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4,16,25,30,37 ℃ fitted by Richards model

使用4 种方程对4、16、25、30、37 ℃进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长情况进行非线性拟合，并由此得到相应模型的拟合参数如表1 所示。由表1 可知，在上述4 种方程拟合得到的决定系数R2均在0.97 以上，表明4 种方程均能较好地描述4～37 ℃温度储存条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长动态。通过比较4 种模型方程R2和RMSE 可知，Modified Gompertz 模型的决定系数R2均较高，分别为0.98、0.99、0.99、0.99 和0.98，RMSE 相对较小，分别为0.04、0.30、0.18、0.22 和0.28，方程拟合性最好，说明Modified Gompertz 模型最适合用来拟合进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长情况，拟合得到的最适一级生长动力学模型见表2。

表1 大肠杆菌在不同温度条件下进口生鲜牛肉中进行4 种模型拟合的决定系数（R2）和均方根误差（RMSE）Table 1 Determination coefficient (R2) and Root-mean-square error (RMSE) of four model fitting methods for E.coli imported raw beef at different temperatures

表2 进口生鲜牛肉中大肠杆菌的最适一级生长动力学模型Table 2 Optimal first-order growth kinetics model of E.coli in imported raw beef

Modified Gompertz 模型拟合本实验中4、16、25、30 和37 ℃进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长情况，并由此得到相应模型的拟合参数如表3 所示。由表3 可知，当储存温度为4、16、25、30、37 ℃时，进口生鲜牛肉中的大肠杆菌的迟滞期分别为16.53、3.75、1.91、1.41、0.95 h，最大比生长速率分别达到0.01、0.19、0.71、0.90、1.08 h−1。结果表明，随着温度的增加，大肠杆菌在进口生鲜牛肉中的μmax值呈上升趋势，λ 值呈下降趋势，说明温度对进口生鲜牛肉中大肠杆菌的λ 和μmax影响均较大。

表3 进口生鲜牛肉中大肠杆菌Modified Gompertz模型的拟合参数Table 3 Fitting parameters of Modified Gompertz model of Escherichia coli in imported raw beef

2.3 二级模型的建立

二级模型可描述温度变化对微生物生长动力学参数的影响，因此选用Ratkowsky 平方根模型作为二级模型，根据Modified Gompertz 模型拟合得到的μmax和λ，应用Origin2019b 软件分别对温度与μmax和λ 之间的关系进行拟合，拟合结果如图6、图7所示。由图6、图7 知，平方根模型拟合的温度与均呈现良好的线性关系，说明该模型能够很好地描述进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长参数与温度之间的关系。

2.4 二级模型的可靠性评价

本文主要是对数学模型参数进行评价，采用决定系数（R2）、均方根误差（RMSE）、偏差因子（Bf）、准确因子（Af）四种参数对所建立的平方根模型的可靠性进行评价，结果见表4。根据对偏差因子（Bf）和准确因子（Af）的划分标准，若Bf值在0.90～1.05 之间，Af值在1.01～1.15 之间，表明模型可以被接受。Bf和Af值越接近于1，模型可靠性越高；R2越接近于1，模型的拟合度越优；均方根误差（RMSE）越小，所建模型越可靠。

由表4 可知，平方根模型的R2分别为0.97、0.99，均较高，预测值和观察值的均方根误差（RMSE）分别为0.08、0.01，误差均较小，在对进口生鲜牛肉中大肠杆菌温度与最大比生长速率（μmax）之间的关系进行平方根模型的拟合时Bf为0.99，Af为1.14，在拟合温度与入之间的关系曲线中，大肠杆菌进行平方根模型拟合的Bf为0.99，Af为1.03，平方根模型的Bf和Af值均接近于1。可见选用的平方根模型对温度与之间的拟合度较高，拟合得到的二级模型可靠性高，因此上述温度条件下建立的二级模型能够被接受。

3 讨论与结论

近些年随着食源性疾病爆发率逐渐增高，美国愈发重视国家食品安全，并且逐渐加强对于药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practices，GMP）以及最终检测制度的管理，至1996 年，美国农业部发起所有肉类和畜禽产品在生产加工过程中实施危害分析关键控制点（Hazard Analysis Critical ControlPoint，HACCP）体系来定量风险评估确保产品安全的建议；并从2000 年起强调，所有的屠宰与加工厂都必须强制实施HACCP 食品安全规划[22]，表明建立快速监测食品中食源性微生物生长繁殖规律的方法十分重要。

图6 平方根模型拟合的进口生鲜牛肉中大肠杆菌最大比生长速率与生长温度的关系曲线Fig.6 Relation curve between the maximum specific growth rate of E.coli and the growth temperature in imported fresh beef fitted by the square root model

图7 平方根模型拟合的进口生鲜牛肉中大肠杆菌迟滞期与生长温度的关系曲线Fig.7 Relationship curve between the hysteresis period and growth temperature of E.coli in imported fresh beef fitted by the square root model

表4 二级模型的评价Table 4 Evaluation of the secondary model

进口生鲜牛肉在运输、储藏和销售过程中要经历更长的时间、更多的温度波动变化，许多研究表明，大肠杆菌是引起牛肉腐败的重要食源性微生物，进口牛肉在运输过程中稍有不慎就可能变质滋生腐败菌，从而导致食源性疾病。如今国民对于进口生鲜牛肉的需求量越来越高，目前对进口生鲜牛肉上大肠杆菌的生长预测模型研究报道较少。本实验选取实际中可能出现的温度变化范围4～37 ℃，此温度范围内建立的大肠杆菌在进口生鲜牛肉中的生长预测模型具有实际意义，故研究大肠杆菌在进口生鲜牛肉上的生长规律并用不同模型模拟其生长情况，建立大肠杆菌在进口生鲜牛肉上的生长模型，不仅能对掌握大肠杆菌在进口生鲜牛肉的生长繁殖规律以及为进口生鲜牛肉的贮藏保鲜提供科学依据，对于保护人类生命健康安全也至关重要。日后对于波动温度变化下进口生牛肉的生长动态变化值得进一步研究。

近年国内外对牛肉中预测微生物方面的研究范围很广，研究对象大多是致使食品腐败变质的腐败菌或者危害人体健康的的致病菌。Yu 等[23]建立了各种包装下生牛肉中金黄色葡萄球菌的预测模型，Li等[24]研究了真空包装的生牛肉中乳酸菌的生长，Juneja 等[25]建立不同环境条件下生碎牛肉中沙门氏菌的生长模型。这些实验结果与本实验相同均表明腐败菌能在牛肉中很好地生长。国内外对大肠杆菌生长预测模型的研究主要针对猪肉、蛋类和乳制品，金鑫等[26]建立了猪背最长肌上大肠杆菌和假单胞菌的预测模型，赵格等[27]在不同温度下以Modified Gompertz 模型拟合致病性大肠杆菌等三种菌在蛋内的生长曲线，以上实验结果与本文均相同，表明Modified Gompertz 模型能很好地模拟不同温度下致病菌的生长情况，说明建立的生长预测模型能很好地反映食品中食源性微生物的生长动态变化情况。大肠杆菌的生长动力学模型至今很多文献已有报道[28−31]，许多研究选用Modified Gompertz 模型建立一级模型，求得模型参数计算出最大比生长速率（μmax）和迟滞期（λ），再利用平方根模型建立二级模型。因此，本实验对于4 种模型的各项相关系数进行对比，选择拟合效果最好的Modified Gompertz 模型作为一级模型，利用Ratkowsy 平方根方程作为二级模型。应用Modified Gompertz 模型建立了4～37 ℃不同贮藏温度条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长预测模型，求得决定系数R2均大于0.97，RMSE 均较小，表明该方程能很好地描述不同温度下大肠杆菌在进口生鲜牛肉中的生长动态，温度对最大比生长速率（μmax）和迟滞期（λ）的影响采用平方根模型进行描述，其R2分别为0.97 和0.99，呈现良好的线性关系，且对模型进行验证得出偏差因子（Bf）为0.99 和0.99，准确因子（Af）为1.14 和1.03，说明该模型能有效预测进口生鲜牛肉中大肠杆菌在4～37 ℃范围内的生长情况。

综上所述，本研究所建立的大肠杆菌生长动力学模型可以快速可靠地实时预测大肠杆菌在牛肉中的生长动态，可以为进口生鲜牛肉中大肠杆菌污染时的预测和监控提供有效的工具，以提高产品的安全性。