红白锦鲤ARTP诱变试验总结

李 泓，王延晖，谢国强，于 潇，王冰柯，朱文锦

（河南省水产科学研究院，郑州450044）

常温常压等离子体 （Atmospheric and Room Temperature Plasma）简称ARTP，指能够在大气压下产生温度在25～40℃之间、具有高活性粒子浓度的等离子体射流，通过照射使生物细胞壁、细胞膜的结构及通透性发生改变，进一步引起核酸损伤，最终产生可稳定遗传的变异体。ARTP照射技术作为一种物理诱变方法，可广泛用于微生物、动物、植物育种，是近年来发展极为迅速的新技术。目前，ARTP诱变技术已成功应用于包括细菌、放线菌、真菌、酵母、微藻等在内的六十余种微生物的诱变育种，在微生物进化研究和微生物工业生产方面发挥着巨大作用；但由于不同生物体生长和结构的差异，该技术在植物、动物体上的应用难度较大，研究相对较少。

红白锦鲤（Cyprinus carpiohaematopterus）是锦鲤中的基础品种，社会知名度和认可度较高。鲤科观赏鱼养殖技术较成熟，其生长优势较明显。红白锦鲤的颜色较简单，诱变对颜色的影响较易识别。本试验通过对红白锦鲤受精卵进行ARTP诱变处理，找出不同照射方案下鱼卵孵化和生长情况的差异，进而比较最优化照射诱变方案，探索通过ARTP技术进行锦鲤诱变育种的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

受精卵来自泌阳县帝苑锦鲤养殖场。母本为优质红白锦鲤，父本为优质银鳞红白锦鲤，亲鱼均达到3龄以上，雄鱼体长50 cm，雌鱼体长55 cm，体重3～3.5 kg。2020年10月14日进行人工授精，随即将受精卵平铺在网片上，网片及受精卵充氧装袋后运输至河南省水产科学研究院渔业科研试验中心，进行ARTP照射试验。

1.2 试验方法

受精后6 h左右，在显微镜下观察受精卵发育程度，当大部分受精卵处于原肠胚期时，开始照射试验。照射时间和照射强度分别设置三个水平，采用双因素交叉分组，另设1组为对照组。实验组编号见表1。

表1 ARTP照射分组

1.3 出苗培育

照射后的受精卵按顺号移入相同规格80 cm×40 cm×60 cm水族箱内，单独孵化饲养，水温控制在17～20℃，箱内放置加温棒和充气棒24 h加温、充氧。3 d后出膜，前3 d投喂蛋黄浆，而后转为丰年虫。各组保持一致的饲养管理条件，气温转暖后，移入室外5 m×5 m硬化水泥池。统计各组孵化率和成活率。

2结果与分析

2.1 总体成活率分析

实验组与对照组受精卵成活率存在较大的差异，对照组37.43%，试验组10%左右。在试验组与试验组之间，成活率差异不显著（图1、表2）。排除由于秋季育苗导致整体成活率不高的因素，通过ARTP照射的受精卵较没有照射的受精卵折损率为75%，即减产3/4。实验组受精卵成活率的高低，决定了实验样本基数的大小，可以作为优化ARTP照射方案的一项参考依据。

表2 孵化情况统计

表3 生长情况统计（3个月）

图1 总成活率图

2.2 照射强度和照射时间对成活率的影响

通过比较不同照射强度和照射时间下的成活率（图2），发现不同强度照射下受精卵成活率不稳定，差异较大；不同时间的照射下受精卵成活率相差不大，且趋于稳定。因此影响受精卵成活率的因素，照射强度＞照射时间。在优化ARTP照射方案上，可以缩短照射时间，以主要控制照射强度为手段进行诱变照射。

图2 照射时间和照射强度对成活率的影响

2.3 突变率的体现

ARTP照射试验的主要目的就是得到能稳定生长的突变种，在受精卵孵化后的生长阶段，部分个体因诱变导致发育畸形，进而在孵化后的一段时期内发生生长中断，因此通过统计前三个月的死亡率，可以一定程度上反映照射产生的突变率。通过统计分析发现，照射强度越高的实验组，在生长的第一个月内幼苗死亡率越高，且最高的实验组死亡率接近70%（图3）；第二个月至第三个月生长趋于稳定，死亡现象较少发生。高畸形率导致了高死亡率的产生，另一方面高畸形率也是增加突变率的体现，因此在本次实验中，较高强度的照射方案诱变效果更好，可以作为优化ARTP照射方案的一项重要依据。

图3 第一个月死亡率对比图

2.4 照射对生长速度的影响

通过分析前三个月实验组与对照组幼苗生长体长情况发现（图4）：实验组生长速度均超过对照组，且在第2个月较为明显；实验组之间的生长速度差异不显著。生长速度不同可以作为ARTP照射的一项评价指标，但由于鱼苗较小，实验组各组样本基数不一且相对较小，前期的生长情况要与后期成鱼的生长情况综合评价。

图4 前三个月鱼苗体长情况

3 讨论

综合分析样本基数、突变率和生长情况，第7组表现较优，后期将基于该组照射时间和强度，继续优化ARTP诱变育种的照射方案。通过此次受精卵ARTP诱变照射试验的实施，课题组认为通过ARTP进行观赏鱼诱变育种是可行的。但是有别于微生物的ARTP诱变育种，动物或植物的常温常压等离子诱变更多的是关注试验过程对个体的影响，其不确定因素更多，需要进一步探索诱变研究的规律和操作规范。

同时，通过本次试验，也发现了一些问题。一是秋季育苗的问题。虽然理论上秋季育苗锦鲤是可行的，但是在实际操作中难度很高，需要完备的硬件设施、优良的实验材料和成熟的人工授精技术。二是幼苗的体质问题。此次试验幼苗的体质相对较弱，虽然进行了对照组实验对比，但对数据的准确性有一定的影响。三是实验样本过少。对试验结果的预估不足，导致最终成活的实验样本过少，不能形成稳定的数据构架，导致如2#、4#存在较大误差的实验组情况。四是试验起步较晚。对实验组和对照组成鱼的观察是此次试验的重要内容，但目前受季节影响，鱼苗生长速度较慢，试验周期过长。下一步工作重点，总结评估试验效果，进一步优化实施方案，在春、夏季开展试验，以弥补此次试验的遗憾和不足。