髓系来源抑制性细胞对非小细胞肺癌患者预后的影响

吴陈新 许 雪 魏 方 蔡树华

我国肺癌发病率呈现逐年增涨趋势，虽然手术、放疗、化疗和靶向治疗方法的不断进步使肺癌患者的总生存期(overall survival，OS)时间延长，但仍难有质的飞越。免疫抑制的微环境是肿瘤发生与侵袭的关键，肿瘤细胞可以重塑微环境，反之重塑的微环境能刺激肿瘤细胞的进展。寻找微环境中生物标志物评估恶性肿瘤预后是目前研究的新方向，而髓系来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是近年来研究的热点之一。目前，研究发现，肿瘤微环境中MDSCs可以分泌多种抑制T淋巴细胞的物质，减低机体的免疫监视，增加肿瘤细胞的免疫逃逸，使微环境更利于肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。在多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等血液系统肿瘤中，MDSCs水平与预后的相关性已被报道，而关于非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)的MDSCs水平与预后关系却鲜有研究，基于此本研究分析MDSCs与NSCLC预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年3月至2020年5月中国人民解放军联勤保障部队第九○一医院肿瘤诊疗中心及心胸外科初治的NSCLC患者54例为试验组，年龄44～78岁，平均(61.4±11.5)岁，男性35例，女性19例。收集患者临床资料,包括年龄、性别、吸烟状态、临床分期、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平、美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)体力评分和OS。临床分期和ECOG评分参照2016年中国临床肿瘤学会NSCLC诊疗指南，所有入组病例均经病理学证实。收集同期本院体检中心健康人30例为对照组，男性18例，女性12例，平均年龄(58.2±9.6)岁。两组对象性别、年龄、吸烟状态差异均无统计学意义(

P

>0.05)。排除传染病及自身免疫性疾病，入组前1个月内未接受过输血、免疫增强剂和/或免疫抑制剂治疗。本研究方案经本院道德伦理委员会审核通过，所有受试者签署知情同意书。

1.2 试剂 CD3-FITC/HLA-DR-PE荧光单克隆抗体试剂、CD45-PC5荧光单克隆抗体试剂、CD14异硫氰酸荧光素抗体(anti-CD14-FITC)及Cytomics FC500MPL流式细胞仪均购于美国贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter)。红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自青岛天祺生物科技有限公司。上述试剂均由合肥金域医学检验实验室有限公司提供。

1.3 检测方法 采集所有对象空腹静脉血10 mL，经乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝处理后编号、登记。① 标本置入离心机中以1 500 r/min的转速15 min；静置后将上层血浆吸入1.5 mL EP管中，按顺序编号标本管及对照管，并放入-70℃的冰箱进行冷冻备用。②取等量生理盐水重悬下层细胞，静止后缓慢加入淋巴细胞分离液。再次以1 500 r/min的转速离心15 min后将云雾状单核细胞层用吸管转移到15 mL离心管中；重复二次重悬细胞、离心、弃去上清。③加入PBS约2 mL洗涤细胞，制得外周血单个核细胞悬液。取100 μL于流式管中；向各管细胞中加入anti-CD14-FITC、anti-CD3-FITC、anti-CD45-PC5抗体各10 μL；4℃避光环境中孵育30 min后，再用2 mL PBS洗涤细胞1次。④最后加入适量固定液300～500 μL。用流式细胞仪收集10 000个细胞/管，应用Cytomics FC500MPL流式细胞仪分析软件提取数据，获取并分析标本管与对照管中CD14细胞里CD14HLA-DRlow/-MDSC细胞所占的百分比。

1.4 观察指标 观察两组对象外周血MDSCs水平；试验组OS、临床资料与MDSCs的相关性；试验组27例患者治疗前后MDSCs水平的变化情况。

2 结果

2.1 相关资料对比 试验组54例初诊NSCLC患者中，1例失访排除。剩余53例初治NSCLC患者，不同年龄、性别、吸烟情况患者外周血MDSCs水平差异均无统计学意义(

P

>0.05)；不同临床分期、LDH水平、ECOG评分患者外周血MDSCs水平差异有统计学意义(

P

<0.05)。见表1。

表1 NSCLC患者外周血中MDSCs水平与相关指标的关系

2.2 外周血中MDSCs表达对比 试验组CD14HLA-DRMDSC细胞比例为(23.56±11.01)%，与对照组的(7.28±2.43)%比较，差异有统计学意义(

t

=10.419，

P

<0.001)。试验组中追踪了27例患者，经过手术、放疗和/或2个及以上周期化疗后，MDSCs水平为(12.30±5.37)%，较治疗前的(23.56±11.01)%(53例群体水平)降低，差异有统计学意义(

t

=6.147，

P

<0.001)。2.3 MDSCs对NSCLC患者OS的影响 53例NSCLC患者随访至2020年9月或死亡为止。中位随访时间为21个月。按NSCLC患者MDSCs的平均值(23.56%)为截断值，将患者分成<23.56%和≥23.56%两组，其中位生存期分别为20和>36(个月)。继而采用Kaplain-Meier法绘制生存曲线，并进行两组生存率比较的Log-Rank检验，结果显示，具有较高MDSCs水平的患者预后更差(Log-Rand

χ

=20.834，

P

<0.001)。见图1。

图1 MDSCs水平对NSCLC患者生存期的影响

2.4 NSCLC患者预后因素分析 建立COX比例风险回归模型，以NSCLC患者预后状况为因变量，赋值1=死亡，0=生存。以表2所列各指标/因素作为自变量，并经临床和统计专家会商确定赋值方案(见表2)。

单因素分析结果显示，临床分期、LDH水平、吸烟情况、ECOG评分、MDSCs水平等5个指标均与NSCLC患者预后有关联(

P

<0.05)。见表2。

表2 非小细胞肺癌患者预后的单因素COX分析结果

再将单因素分析中

P

<0.10的指标(共5个)作为自变量纳入多因素分析，结果显示临床分期(Ⅲ～Ⅳ期)及MDSCs水平(较高水平)是NSCLC患者预后的危险因素(

P

<0.05)。见表3。

表3 非小细胞肺癌患者预后的多因素COX分析结果

3 讨论

机体内肿瘤细胞的发生及进展与免疫抑制性微环境相关，免疫抑制性细胞、抑制分子和抑制性细胞因子为主要构成成分。其中免疫抑制性细胞主要包括MDSCs、肿瘤相关巨噬细胞、调节性T细胞等。MDSCs是肿瘤免疫逃逸的关键因素，一方面表达多种促血管形成因子促进肿瘤新生血管的形成；另一方面分泌多种细胞因子抑制宿主固有免疫及减弱适应性免疫，使免疫细胞减弱或失去清除和杀伤肿瘤细胞的能力，从而促进肿瘤进展。

研究发现，人类MDSCS研究中并没有明确统一的免疫表型。参照小鼠MDSCs分型，人类MDSCs分为2大类：单核细胞型(M-MDSCs)和粒细胞型(PMN-MDSCs)，因为血液样本中鉴定PMN-MDSCs存在一定的技术问题，实际研究中关于M-MDSCs的研究项目较多，常以CD14HLA-DRlow/-为标志物。本研究中选取MDSCs的表型也是参照此研究基础。

本研究检测了NSCLC患者和健康体检者外周血MDSCs水平，并分析外周血MDSCs水平和相关临床病理特征的相关性。结果显示NSCLC患者外周血MDSCs水平明显高于健康体检者，表明肿瘤细胞可以诱导和招募MDSCs进入外周血，并增殖、分化，使机体处于免疫抑制状态。此外，本研究还发现临床分期、血清LDH水平、ECOG评分与外周血MDSCs水平相关。临床分期越晚、LDH值越大、ECOG体力评分越差的患者，其外周血MDSCs水平越高。临床分期体现NSCLC的侵袭度，血清LDH和ECOG评分被认为是NSCLC预后不良因素。因此，从侧面反映MDSCs高水平与肺癌患者预后不良相关。安晓华等研究表明，NSCLC临床分期与外周血MDSCs正相关，可作为判断预后的一个独立标志；王静之等和王治宽等也证实MDSCs可以作为判断恶性肿瘤患者预后的一个生物标志物。

本研究发现，通过手术、放化疗等手段，可使恶性肿瘤的MDSCs水平下降，其可能原因：①患者体内的肿瘤负荷降低，肿瘤细胞产生的活性因子如白细胞介素-6、前列腺素和环加氧酶-2等减少，诱导MDSCs聚集的能力下降，导致外周血MDSCs水平降低；②细胞毒性药物对外周血的MDSCs具有特异性杀伤作用。大量的动物实验已证实培美曲塞、顺铂和吉西他滨可优先清除MDSCs，增加CD8T细胞的应答能力。

在研究NSCLC患者OS与MDSCs水平的单因素分析中发现，MDSCs水平低于截断值的患者生存期明显优于MDSCs高于截断值的患者。多因素分析表明，MDSCs系NSCLC患者的独立危险因素。但由于本研究周期短，未能对复发、转移患者的MDSCs水平进行连续监测，还不能直接证明MDSCs为判断NSCLC患者预后的生物标志物，今后会在随访工作中进一步研究。综上所述，检测外周血MDSCs水平，可作为判断NSCLC患者预后的重要指标。