黑果腺肋花楸多糖的提取及抗氧化活性研究

马士超 贾艳菊 马启迪 张寿常 林龙慧美 于梦 李振

摘要 [目的]研究黑果腺肋花楸多糖的最佳提取工艺，并考察其体外抗氧化活性。[方法]采用超声波辅助提取，探究提取温度、提取时间、超声功率、料液比对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响，采取正交试验法对其工艺参数进行优化，并进行体外抗氧化活性分析。[结果]超声波辅助提取黑果腺肋花楸多糖最佳工艺为提取时间30 min、料液比1∶25、提取温度30 ℃、超声功率360 W，在此条件下，黑果腺肋花楸多糖提取率为13.09%。在黑果腺肋花楸多糖浓度为6.0 mg/mL时，其对·OH清除率为73.08%;当浓度为0.60 mg/mL时，其在所选浓度范围内还原能力最大，吸光度为0.879，对DPPH自由基的清除率达97.99%。[结论]该研究可为黑果腺肋花楸多糖工业化生产提供理论依据，并对其食品开发具有重要意义。

关键词 黑果腺肋花楸;多糖;提取;抗氧化活性

中图分类号 R284文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）02-0154-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.042

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Sorbus arborescens

MA Shichao，JIA Yanju，MA Qidi et al

（College of Pharmacy，Linyi University，Linyi，Shandong276005）

Abstract [Objective]To study the best extraction process of polysaccharides from Sorbus arborescens and to investigate its antioxidant activity in vitro. [Method]Ultrasoundassisted extraction was used to explore the effects of extraction temperature， extraction time， ultrasonic power， and solidliquid ratio on the extraction rate of polysaccharides from S. arborescens， and orthogonal process was used to optimize its process parameters. The antioxidant activity in vitro was analyzed. [Result]The best technology of ultrasonicassisted extraction of polysaccharides from S. arborescens was extraction time 30 min， solidliquid ratio 1∶25， extraction temperature 30 ℃， ultrasonic power 360 W. Under those conditions， the extraction rate of S. arborescens polysaccharide was 13.09%. At the concentration of 6.0 mg/mL polysaccharides of S. arborescens， the scavenging rate for hydroxyl radicals was 73.08%; when the concentration was 0.60 mg/mL， the reducing power（0.879） was the largest in the selected concentration range， for DPPH，the free radical scavenging rate reached 97.99%. [Conclusion] This research can provide a theoretical basis for the industrial production of polysaccharides from S. arborescens and has important significance for the development of its food.

Key words Sorbu arborescens;Polysaccharides;Extraction;Antioxidant activity

黑果腺肋花楸又名野櫻莓、不老莓，属蔷薇科植物[1-2]。原盛产于北美州的东北部，国外已经有几百年的种植经验[3-4]。其果实中含有丰富的原花青素、酚酸、多糖等多种活性成分[5-6]，具有抗疲劳、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用[2]。多糖是由醛基和羰基通过苷键连接的高分子聚合物，广泛存在于植物中，可清除机体自由基，防治细菌、病毒、肿瘤、糖尿病等疾病。因此，积极开发植物多糖具有重要的临床价值。该研究拟测定黑果腺肋花楸多糖的含量，筛选出最佳提取工艺，考察其体外抗氧化作用，以期为黑果腺肋花楸的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：黑果腺肋花楸果实（辽宁鞍山）;试剂：葡萄糖（分析纯）、浓硫酸、6%苯酚、70%乙醇、水杨酸、无水乙醇、FeSO4、H2O2、NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、K3[Fe（CN）6]、三氯乙酸（TCA）、FeCl3、Tris-HCl缓冲液（pH=8.2）、邻苯三酚均为市售分析纯试剂。试验用水均为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

TU1820紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;BSA124S电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）;KQ-600E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;DJ-10A粉碎机（青州精诚医药装备制造有限公司）;TG16-WS离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）;DK-S26电热恒温水浴锅（上海森信试验仪器有限公司）;BCD-331WDGQ冰箱（海尔集团）。

1.3 方法

1.3.1 材料处理。

取黑果腺肋花楸果实，烘干，粉碎，过80目筛，备用。

1.3.2

葡萄糖标准曲线绘制。精确称取经干燥恒重的葡萄糖标准品10 mg，加蒸馏水溶解并定容至100 mL，配成100 μg/mL葡萄糖标准溶液。分别吸取葡萄糖标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 置于试管中，加蒸馏水至 10.0 mL。分别用移液管移取2.0 mL 于比色管中，加入苯酚溶液 1.0 mL，摇匀，迅速加入5.0 mL 浓硫酸摇匀，静置10 min，40 ℃水浴30 min。以葡萄糖标准溶液质量浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线（图1）。

试验所得线性回归方程为y=0.017 3x+0.049 0，式中y为吸光度（A），x为质量浓度（μg/mL），R2=0.987 6，表明在该浓度范围内葡萄糖浓度与吸光度线性关系良好。

1.3.3 黑果腺肋花楸多糖提取率的测定。

取一定量的黑果腺肋花楸果实粉末溶于70%乙醇溶液中，采用超声波辅助提取;滤纸过滤，滤液条件为 5 000 r/min 离心10 min;取上清液定容于 50 mL容量瓶，根据苯酚-硫酸法测定黑果腺肋花楸多糖含量，根据下式计算黑果腺肋花楸多糖的提取率：

黑果腺肋花楸多糖提取率=10-6XVnm×100%

式中，n为稀释倍数;X为葡萄糖质量浓度（μg/mL）;V为提取液体积（mL）;m为预处理后粗多糖质量（g）。

1.3.4 单因素试验。

分别以料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]、超声功率（240、300、360、420 W）、提取时间（10、20、30、40 min）、提取温度（30、40、50、60 ℃）4个因素进行单因素试验，研究各因素对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响。

1.3.5 正交试验。

以黑果腺肋花楸多糖提取率为评价指标，考察超声辅助提取中提取时间、料液比、提取温度、超声功率4个因素对黑果腺肋花楸多糖提取的影响。根据单因素试验结果确定各个因素的水平，并以此进行L9（34）正交试验，因素和水平见表1。

1.3.6 黑果腺肋花楸多糖体外抗氧化活性测定。

1.3.6.1 ·OH清除率的测定。

对照组（A0）：1.0 mL蒸馏水+2.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4+2.0 mL 9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液+2.0 mL 0.88 mmol/L H2O2溶液。样品组（A1）：取1.0 mL 不同质量浓度的黑果腺肋花楸多糖提取液+2.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4+2.0 mL 9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液+2.0 mL 0.88 mmol/L H2O2溶液。空白组（A2）：1.0 mL蒸馏水+2.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4+2.0 mL 9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液+2.0 mL蒸馏水。37 ℃水浴30 min，于510 nm波长处测定吸光度[8-9]。

·OH清除率=（1-A1-A2A0） ×100%

式中，A1为样品溶液的吸光度;A0为对照溶液的吸光度;A2为空白溶液的吸光度。

1.3.6.2 还原力的测定。

取不同质量浓度的黑果腺肋花楸多糖提取液1.0 mL于试管中，各加入2.0 mL 0.2 mol/L pH为6.6的磷酸盐缓冲溶液和1%K3[Fe（CN）6]溶液混匀，50 ℃水浴20 min后，立即冷却至室温，加入2.0 mL10%三氯乙酸，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸馏水和0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，摇匀，常温下反应30 min后，用蒸馏水代替样品作为空白，于700 nm波长处测定吸光度。吸光度越大表明还原力越大[10]。

1.3.6.3 DPPH自由基清除能力的测定。

参考Brand[7]的方法测定，取不同质量浓度的黑果腺肋花楸多糖提取液1.0 mL于試管中，分别加入4 mmol/L DPPH乙醇溶液 1.0 mL，混匀，暗处静置30 min，以2.0 mL乙醇作为空白，1.0 mL 4 mmol/L DPPH乙醇溶液与1.0 mL乙醇混合液作为对照，于517 nm波长处测定吸光度。DPPH自由基清除活性（RAS）计算公式如下：

DPPH自由基清除率=（1-A1/A0）×100%

式中，A1为样品溶液的吸光度;A0为对照溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响。

由图2可知，在超声功率为360 W、提取时间30 min、提取温度50 ℃条件下，料液比对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响结果：料液比在1∶10～1∶15时黑果腺肋花楸多糖提取率显著增加;料液比1∶20～1∶25时，提取率显著降低;料液比为1∶15时多糖提取率达到峰值，为11.49%。故最佳料液比为1∶15。

2.1.2 超声功率对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响。

由图3可知，在料液比1∶15、提取时间30 min、提取温度50 ℃条件下，超声功率对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响结果：超声功率在240～360 W时，提取率随超声功率的增大而增加;360 W以后提取率呈减小趋势，最大提取率为11.56%。故最佳超声功率为360 W。

2.1.3 提取时间对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响。

由图4可知，在料液比1∶15、提取温度50 ℃、超声功率360 W条件下，提取时间对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响结果：在10～30 min，随提取时间的增加，黑果腺肋花楸多糖提取率不断增加;在30 min后，提取率呈下降趋势，最大提取率为1017%。故最佳提取时间为30 min。

2.1.4 提取温度对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响。

由图5可知，在料液比1∶15、提取时间30 min、超声功率360 W条件下，提取温度对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响结果：30～40 ℃ 时提取率呈缓慢增加趋势;50～60 ℃时提取率呈缓慢下降趋势，最大提取率为11.69%。故最佳提取温度为40 ℃。

2.2 黑果腺肋花楸多糖提取工艺的优化

在超声辅助乙醇法提取黑果腺肋花楸多糖单因素试验结果的基础上，研究黑果腺肋花楸多糖的提取率与料液比、提取温度、超声时间、超声功率之间的相互关系，并确立最优组合，以得到黑果腺肋花楸多糖的最佳提取条件，上述4因素各取3水平，采用L9（34）正交试验设计，正交试验结果见表2。

通过提取率极差分析结果可知，影响黑果腺肋花楸多糖提取率的因素依次为B>A>D>C，即料液比影响最大，提取温度影响最小。试验指标提取率越大越好，从k得出黑果腺肋花楸多糖的最佳提取条件为A3B3C1D2，即提取时间30 min、料液比1∶25、提取温度30 ℃、超声功率360 W。由方差分析结果可知，因素B 对黑果腺肋花楸多糖提取率有显著影响（P<0.05），因素 A、C、D 对黑果腺肋花楸多糖提取率无显著影响（P>0.05），对多糖提取率影响的主次顺序为B>A>D>C，即料液比、提取时间、超声功率、提取温度，与直观分析结果一致。

2.3 黑果腺肋花楸多糖体外抗氧化活性测定

2.3.1 黑果腺肋花楸多糖对·OH清除率的影响。

·OH一般被认为是活性最强的自由基，也是毒性最大的自由基，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成[11]。由图6可知，在所选浓度范围内随着浓度的增大，黑果腺肋花楸多糖对·OH清除率也逐渐增大，当多糖浓度为6.0 mg/mL时，清除率达73.08%。

2.3.2 黑果腺肋花楸多糖还原力的测定。

由图7可知，在所选浓度内，随着黑果腺肋花楸多糖浓度的提高，其还原力逐渐增强，当多糖浓度为6.0 mg/mL时，其对铁还原能力为最大，吸光度为0.879。

2.3.3 黑果腺肋花楸多糖对DPPH自由基清除率的测定。

DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，当有自由基清除剂存在时，由于其单电子配对而使其颜色由深紫色褪至黄色，其褪色程度与自由基清除能力存在一定的关系，被色程度越明显，清除能力越强[12-14]。由图8可知，黑果腺肋花楸多糖对DPPH自由基有明显的清除能力。在所选浓度内，多糖的清除能力随其浓度的增加而增大，在浓度为0.60 mg/mL时，黑果腺肋花楸多糖对DPPH的清除率达97.99%。

3 结论

该研究采用超声辅助提取黑果腺肋花楸多糖，通过考察

料液比、提取时间、提取温度和超声功率对黑果腺肋花楸多糖提取率的影响，结果表明当料液比为1∶25、提取温度为30 ℃、提取时间为30 min、超声功率为360 W时，黑果腺肋花楸多糖提取率最高，为13.09%。黑果腺肋花楸多糖对 DPPH、·OH均具有较强的清除能力，且随多糖浓度的增加清除能力也逐渐增强，在黑果腺肋花楸多糖浓度为6.0 mg/mL时，对·OH清除能力为73.08%;在黑果腺肋花楸多糖浓度为0.60 mg/mL时，在所选浓度内还原能力最大，吸光度为0.879，对DPPH自由基的清除率达97.99%。由此可知，黑果腺肋花楸多糖具有一定的抗氧化活性。

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