快速测定多花黄精种子活力的TTC染色法条件研究

胡迎峰 穆帅 张家祥 黄颖 张思宇 刘慧君

摘 要：采用TTC染色法對多花黄精种子进行活力测定，通过5因素4水平正交试验，探究浸种温度、浸种时间、TTC溶液浓度、染色温度及染色时间对TTC染色法测定效果的影响。结果表明：多花黄精种子TTC染色的最佳条件为：30℃的条件下水浴浸种6h，并用浓度为0.3%的TTC溶液在40℃条件下避光染色24h。

关键词：多花黄精;TTC染色法;正交设计;种子活力

中图分类号 S567.23文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）10-0031-03

Study on the Rapid Determination of Seed Vitality of Polygonatum cyrtonema Hua by TTC Staining

HU Yingfeng et al.

（Anhui Normal University College of Life Sciences， Wuhui 241000， China）

Abstract： In this paper， TTC staining was used to determine the seeds vitality of Polygonatum cyrtonema Hua. The experiment was conducted with 5 factors and 4 levels orthogonal design to investigate the effects of the seed soaking temperature， the seed soaking time， the concentration of TTC solution， the dyeing temperature and the dyeing time on TTC staining. The results showed that the best condition for TTC staining of Polygonatum cyrtonema Hua was to soak seeds in water bath for 6 hours at 30 ℃ and to avoid light staining for 24 hours with 0.3% TTC solution.

Key words： Polygonatum cyrtonema Hua; TTC method; Orthogonal design; Seed vigor

多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）隶属于天门冬科（Asparagaceae）黄精属（Polygonatum），现广泛分布于华东、华中以及西南等地[1]。根据中国药典记载，其根状茎可入药，具有补脾润肺、生津止渴等作用[2]。近年来，随着多花黄精用途不断的被开发，其市场需求和价格均在稳步上升，野生资源已无法满足人们的需求[3]。因此，在多花黄精产业的发展过程中，人工种植已成为扩大产量的最佳途径。其中，最重要就是选种和育种工作，而种子质量又与种子活力有密切关联[4]。至今，有关多花黄精种子活力的研究仅见傅飞龙等的初步报道，且未提供研究的具体数据和结果[5]，对多花黄精种子活力的探究仍缺乏准确的方法和实验数据。为此，本研究选用2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色法（TTC染色法）对种子活力进行探究多花黄精种子活力测定的最适条件[6-10]，以期为多花黄精的育种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料 试验采用的多花黄精种子于2020年10月购自安徽省六安市金寨县规模化种植基地。将种子从果实中洗出后，随机混合，并通过水选法去除不合格种子[11]，留下下沉种子即颗粒饱满的优质种子进行测试。

1.2 预实验及结果 在确定正式试验方案之前，采用未完全成熟的绿色多花黄精种子和相对激进的水浴温度开展了一系列的预试验。试验发现：（1）使用未完全成熟的绿色多花黄精种子进行TTC染色时，通过多次不同条件的检测，活力均为100%。（2）当对多花黄精种子的水浴温度超过55℃，水浴时间超过24h，会导致种子完全失活（TTC染色法活力检测显示完全无活性）;而对多花黄精种子的水浴温度低于20℃，且水浴时间少于6h，则会导致显色现象不明显。因此，在挑选实验所需的种子时，需要避开绿色多花黄精种子，由于其未完全成熟，导致活性物质含量过高并无探究意义[12-13]。在设计试验时，需要控制水浴温度在20～55℃，控制水浴时间在6～24h。

1.3 TTC溶液的配制和浸种处理 用蒸馏水和2，3，5-氯化三苯基四氮唑粉剂配制成1.0%、0.5%、0.3%和0.1%TTC溶液[9]。将多花黄精种子分别放入加入等量蒸馏水的小烧杯中，并使种子完全浸没，置于20℃、30℃、40℃和50℃水浴锅内进行水浴，分别浸泡6h、12h、18h和24h，每个处理使用50粒种子[10]。

1.4 正交试验 利用多份多花黄精种子，采取L16（45）5因素4水平正交设计（见表1），选择影响染色效果的浸种温度、浸种时间、TTC溶液浓度、染色温度和染色时间5个因素为检测指标，每个因素设置4个水平进行试验。

1.5 染色处理 种子经水浴后取出，用吸水纸将种子表面的水分吸干，并利用手术刀将种子切割下1/3，将留有种胚的那部分放置于培养皿中[6]。按正交试验设计方案，将等量的浓度分别为1.0%、0.5%、0.3%和0.1%的TTC溶液分别加入各个培养皿中，直至种子完全浸没。将种子分别置于温度为20℃、30℃、40℃和50℃的恒温箱内，分别避光染色6h、12h、18h和24h后取出，用蒸馏水冲洗3次，观察染色结果，凡胚被染为红色的种子被认定为有生活力的种子[14]。

1.6 數据处理 使用SPSS 21.0对数据进行分析，以筛选TTC染色法测定多花黄精种子生活力的最佳条件。种子活力的计算公式如下：

种子活力百分数（%）=（被染色的种子数量/染色种子总数）×100

2 结果与分析

2.1 TTC染色法活力测定结果 多花黄精种子活力测定结果如表2所示。其中，本试验中多花黄精种子活力最高的为组合5，种子活力百分数为90%，即在30℃的条件下水浴浸种6h，并用浓度为0.3%TTC溶液在40℃条件下染色24h。种子活力测定值最低的为组合16，种子活力百分数为6%，即在50℃的条件下水浴浸种24h，并用浓度为0.1%TTC溶液在40℃条件下染色12h。

2.2 极差分析 对数据进行极差分析（见表3），比较5个不同的因素对多花黄精种子活力测定结果的影响，5种因素的极差值分别为138%、74%、42%、102%和100%。由此可见，在对多花黄精种子活力测定过程中，影响因素最大的是浸种温度，符合预试验中水浴温度超过55℃会导致种子完全失活的预期。其次，对种子活力的影响程度由大到小依次为染色温度>染色时间>浸种时间>TTC浓度。其中，TTC浓度对多花黄精种子活力的测定影响最小。对由5种因素中的4个水平所对应的L1、L2、L3、L44个不同的组合进行进一步分析，选择每个因素对应的种子活力最大值的水平来表示适合多花黄精种子活力测定的最佳条件。其中，浸种温度对应的活力最大值为L2，最适浸种温度即为30℃;浸种时间对应的活力最大值为L2，最适浸种时间即为12h;TTC浓度对应的活力最大值为L2，最适TTC浓度即为0.3%;染色温度对应的活力最大值为L2，最适染色温度即为30℃;染色时间对应的活力最大值为L4，最适浸种时间即为24h。综上所述，多花黄精种子在30℃恒温水浴12h后，使用浓度为0.3%的TTC溶液，在30℃条件下避光染色24h为最优组合。

3 讨论

3.1 TTC法测定多花黄精种子活力的最优条件 由正交试验结果表明，种子平均生活力百分数最高的为90%，对应处理组合5，即在30℃的条件下水浴浸种6h，并用浓度为0.3%TTC溶液在40℃条件下染色24h。而通过极差分析表明，多花黄精种子在30℃恒温水浴12h后，使用浓度为0.3%的TTC溶液，在30℃条件下避光染色24h为最优组合。对比发现，仅在浸种时间和染色温度上存在差异，且差异较小，处理组合5可以作为最优条件。综上所述，多花黄精种子TTC染色的最佳条件为：在30℃的条件下水浴浸种6h，并用浓度为0.3%的TTC溶液在40℃条件下染色24h。

3.2 TTC法测定多花黄精种子活力的可行性分析 TTC染色法是一种常用于种子活力检测的一般方法，其测定结果与种子发芽率较为接近。种子活力的高低对多花黄精在产业化育种过程中至关重要[15-16]，直接关系到企业生产过程中的沉默成本，对于企业的持续盈利能力至关重要。TTC染色法测定多花黄精种子活力仅需30h，缩短了传统育种手段测定种子活力所需的时间和精力。因此，在生产实践过程中，可使用TTC染色法来判断种子的质量，进而推测种子潜在的萌发率。

参考文献

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（责编：张宏民）