高原肉鸡肺动脉平滑肌细胞的分离、鉴定及低氧对其增殖的影响

常振宇,董海龙 ,李家奎,吴庆侠*

(1.西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝860000;2.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉430070)

肉鸡肺动脉高压综合征 ( pulmonary arterial hypertension，PAH) 是由多病因所致的一种以肺动脉压力增高为特点的疾病或综合征，主要通过血管收缩、肺血管重构来诱发右心衰竭，直至腹水死亡[1]。肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)位于肺动脉血管内皮细胞下层，参与多种病理反应的发生发展过程，如高原缺氧、肉鸡腹水肺动脉高压综合征、自由基损伤、动脉粥样硬化等[2-4]。另外，肉鸡肺动脉血管内膜及中膜PASMCs的增殖、肥大可以诱导低氧性肺血管收缩和血管重构，且肉鸡PAH综合征形成过程中具有这一特征，国内外学者研究发现低氧应激在PAH血管重构中发挥关键作用[5-8]。因此探讨研究肺血管重构机制的关键环节就是体外培养PASMCs，因此需要建立PASMCs培养方法。虽然国内外关于人、鼠和猪等哺乳动物的PASMCs培养方法已建立培养体系，但目前有关高原缺氧条件下肉鸡PASMCs的体外培养的研究少有报道[9-11]。肉鸡PASMCs培养方法主要有组织贴块法和酶消化法两种，但酶消化法步骤繁琐，酶消化时间难掌控，所需胶原酶价格昂贵不经济，所需成本较高[12-15]。近年来的研究开始以PASMCs作为细胞模型来探讨PAH的分子机制[16]。本试验以高原肉鸡肺主动脉组织作为来源，通过N2诱导低氧条件下培养，并采用组织贴块培养法更为稳定可靠，为在体外细胞培养条件下研究低氧对PASMCs 增殖的机制提供参考，并为研究缺氧--肺血管重构--PAH发病机制及其他相关研究提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物1日龄的健康AA肉鸡10只。

1.2 主要试剂PBS液(现用现配)；胰蛋白酶、100 U/mL 青霉素和100 g/mL链霉素(武汉谷歌生物有限公司)；胎牛血清(Gibco，四季青公司)；D-Hank's液(武汉谷歌生物有限公司)；DMEM/F12培养基(Gibco，四季青公司)；2%台盼蓝试剂(Sigma)；灭菌载玻片、DMSO(Sigma-Aldrich)；L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)；鼠抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体ACTA-2(武汉博士德公司)。

1.3 主要仪器倒置显微镜(BX435)；厌氧培养箱(SHELLAB)；超净工作台(JT-B型)

1.4 PASMC原代培养采用空气静脉注射法处死肉鸡，解剖剪剪开胸腹部，灭菌镊子、剪刀等无菌取出肉鸡肺动脉，并将肺动脉浸入D-Hank's液，分离细胞之前将肉鸡肺动脉放于冰上。在无菌操作台上将肺动脉放入150 mm×25 mm Petri 培养皿中，用解剖剪沿长轴剪开肺动脉，用手术刀片轻轻刮去动脉内腔面，去除内皮细胞，用D-Hank's 液反复冲洗。用解剖剪将中膜剪成约1 cm2的组织块，放入60 mm×15 mm Petri培养皿，内膜侧朝下，让组织块贴壁约10 min，并在组织块上注入1 mL DMEM/F12。将组织块放入饱和湿度的培养箱，在37℃和体积分数5% CO2条件下培养。第2天加入5 mL DMEM/F12，沿壁缓慢加入。继续培养，每日观察，待组织液变黄时，换液。同时用显微镜观察细胞的生长情况，待细胞生长接近单层时，用0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 混合液传代。

1.5 PASMC传代培养待原代培养的PASMCs生长融合到培养皿面积的80%以上时即可进行传代。吸弃原培养液，用D-Hank's 液冲洗。以 0.02% EDTA和 0.05% 胰蛋白酶室温下进行消化5～7 min，观察细胞出现缝隙但未浮起时，吸弃消化液。加入5 mL含5%胎牛血清，吹打10余下并将细胞制成均匀的混悬液，注意吹打时不可过于猛烈，尽量避免气泡出现，将细胞液接种到新的培养瓶中培养，待细胞长满皿底 80% 时按上述方法依次传代。

1.6 PASMC免疫组化鉴定将第 4 代传代细胞用固定液(4%多聚甲醛)固定50 min，PBS溶液清洗3次，0.5% Triton X-100孵育15 min，PBS 清洗3～4次。3% 双氧水(H2O2)孵育10 min，PBS 清洗3～4次。滴加1∶100 鼠抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(ACTA-2)，过夜。PBS清洗3～4次，山羊抗兔HRP- IgG为二抗，孵育，按说明书进行二氨基联苯胺法显色操作，梯度酒精脱水、透明和封片。应用 Olympus 光学显微镜进行观察并拍照。

1.7 低氧培养PASMCPASMCs消化后分为常氧组和低氧组培养。常氧组为正常氧浓度培养，而低氧组持续低流量通入氮气，通过数字监控器控制氧浓度为1.0%。

1.8 生长曲线的测定试验采用第 4 代细胞，96孔板中接种PASMCs约103个/孔，分为常氧组和低氧组，每组设6个复孔分别在常氧和低氧条件下培养 0，4，8，12，24，48和72 h 后，取出培养板，每孔加入100 μL 含有10 μL CCK-8溶液的 DMEM/F12 培养基，37 ℃继续孵育2 h，检测 425 nm 处的D值。并绘制生长曲线，纵坐标为细胞数，横坐标为培养时间。

2 结果

2.1 藏鸡PASMCs的生长情况培养后4 d在倒置显微镜下可见少量细胞从组织块周围呈放射状爬出，放射状排列，PASMCs呈长梭形或三角形，爬出的细胞形成细胞簇，细胞形状多不规则，形态不清晰(图1A)。7 d后长成细胞单层，邻近组织块的细胞密集，胞体较小，形态仍不清晰(图1B)。本试验培养的藏鸡 PASMCs 在体外可传 5～7代。

2.2 藏鸡PASMCs的鉴定

2.2.1藏鸡PASMCs形态学观察 通过倒置显微镜下观察，PASMCs细胞呈长梭形或三角形，放射性生长，成簇的PASMCs细胞平行排列，高低起伏(图2A);培养4 d呈现平滑肌细胞特有的“峰-谷”状(图2B)。

A.倒置显微镜下PASMCs形态；B.培养4 d PASMs呈平滑肌细胞特有的“峰-谷”状

2.2.2免疫组化鉴定 免疫组化结果表明，藏鸡肺动脉平滑肌细胞的ACTA-2单克隆抗体免疫组化结果呈现阳性反应，染色可见胞浆染成棕红色，胞核位于细胞中央，高倍镜下可见胞浆内有明显的细丝(图3)。计数 100 个细胞，肺动脉平滑肌细胞的染色阳性率超过95%。

图3 藏鸡PASMCs的ACTa-2免疫组化染色鉴定(×400)

2.3 常氧与低氧组 PASMCs 形态差异PASMCs分别于常氧和低氧下培养，培养4 d后结果如图4所示，常氧下PASMCs正常稳定生长，细胞形态呈长梭形或多角形，细胞比较圆润。低氧下PASMCs数量变少，细胞变细变长，且间隙增大。

A.常氧条件下培养4 d的藏鸡原代PASMCs (×200);B.低氧条件下培养4 d的藏鸡原代PASMCs (×200)

2.4 常氧与低氧组PASMCs的生长曲线如图5所示，CCK-8法检测PASMCs生长曲线，常氧组和低氧组PASMC的D值随时间的增加而增高。但整体D值常氧组(1.462±0.253，n=8)显著高于低氧组(0.844±0.047，n=8)，常氧组PASMCs生长较低氧组快，增殖速度也明显。

图5 PASMCs 在常氧与低氧条件下生长曲线图与低氧组比较

3 讨论

PAH又称肉鸡腹水综合征，是家禽发生的一种以缺氧、腹部膨大、不愿运动、肺动脉压力升高及右心衰为特点的综合征。肉鸡肺动脉高压是以肺动脉压血管重构为特征的一组疾病，且众多研究揭示肺血管重构是其中心环节之一，PAH的主要病理变化是血管壁重构、血管收缩及原位血栓的形成，其中PASMCs增殖是血管壁重构的关键环节。目前所有在体实验均证实，肺血管重构是肉鸡低氧性肺动脉高压不可逆转的关键因素和血管变化特征，其主要病理变化是低氧可以刺激PASMCs异常增殖，并诱发PAH[17-18]，但缺氧条件下其发生的机制尚未了解，体外细胞培养结果却不一致[19]。低氧是导致肺动脉高压的一个关键因素，体外原代分离培养细胞可以排除众多因素干扰，也可以模拟体实验结果，本试验通过组织贴壁法，采用低氧培养箱体外培养PASMCs的方法成功模拟低氧模型，利用ACTA-2鉴定第4代PASMCs，并通过观察低氧对PASMCs增殖的情况，探讨低氧性肺动脉高压的发病机制。

平滑肌细胞体外培养典型的特征是细胞呈长梭形或三角形，并有典型的“峰-谷”状外观。本方法培养的细胞符合这一形态特征，另外经免疫组化方法对平滑肌特异性的ACTA-2 抗体检测结果呈阳性，表明所培养的细胞是肉鸡PASMCs。本试验采用改良贴壁法获得的 PASMCs方法简便，且细胞纯度和状态均符合实验条件，为研究肺循环疾病相关病理机制和防治提供了较好的实验条件，并为探索肺循环疾病的病理机制寻找防治疾病的新靶点和药物提供实验条件。

本试验通过在细胞培养条件基础上去探讨常氧和低氧条件对高原肉鸡PASMCs的影响，可以忽略神经体液等的影响，更直观的阐明低氧对PASMCs的直接影响。有研究发现低氧能够抑制犊牛PASMCs的增殖[20-21]；也有人认为只有预先用佛波酯(PMA)激活蛋白激酶C，低氧条件下培养的 PASMCs 数目才会显著增加，且低氧不能直接诱导体外培养的PASMCs 增殖[22-23]；徐敦全等[24]认为雌激素会显著降低低氧条件下 PASMCs 的增殖。DEMPSEY等[22]发现，在同条件下的低氧环境中，猫肺动脉平滑肌血管内径在200～600 μm收缩明显，而血管内径大于800 μm收缩不显著，造成此现象主要是由于PASMCs的肌球蛋白轻链对低氧的刺激不发生磷酸化而导致。本试验显示低氧培养不同时间点，PASMCs的增殖情况有较大差异，相对于常氧培养，短期低氧并不会改变PASMCs的生长状况，而长时间低氧培养对PASMCs的增殖并没有促进作用。

总之，本试验成功进行了藏鸡PASMCs的分离、培养及鉴定，建立了体外培养条件下稳定传代的PASMCs体系，通过探讨低氧对其增殖的影响，为进一步研究禽类心血管系统疾病及其他方面的应用提供了重要的试验材料和参考依据。