基于rbcL序列的大麻鉴定

夏若成，张晓春，王笑笑，杨琪，陈冲，于欢，屈轶龄，王紫薇，施妍，向平，张素华，李成涛

1.温州医科大学基础医学院法医学系，浙江 温州 325235；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.苏州大学医学部法医学系，江苏 苏州 215123；4.山西医科大学法医学院，山西 太原 030001；5.西安交通大学医学部法医学院，陕西 西安710061

大麻（Cannabis sativaL.）是大麻科（Cannabaceae）大麻属（Cannabis）一年生雌雄异株的草本植物，且大麻属中只有大麻一个物种，主要分布于欧洲、非洲和亚洲的印度、尼泊尔、中国等地区，是地球上最古老的栽培作物之一[1]。大麻纤维是良好的纺织和造纸原料，植株内含有的四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）被广泛应用于医药卫生领域，其种子富含人体易吸收的蛋白质、不饱和脂肪酸以及微量元素等多种营养成分，已成为许多国家重要的经济作物。然而，由于大麻的花和叶中含有THC 这个具有强烈成瘾性和麻醉性的致幻成分，已被联合国禁毒公约列为与海洛因、可卡因并列的三大毒品之一[2]，大麻也是全球范围内种植、生产、贩卖和吸食最广泛的毒品。近年来，受到国际上一些国家和地区大麻合法化的影响，我国吸食和滥用大麻的人数持续上升，跨国贩卖大麻案件日益增多。因此，如何对大麻进行快速、准确的司法鉴定已然成为迫切的社会需求。

目前常规的大麻鉴定方法主要是进行形态学和化学成分的分析。然而，在一些案件中，大麻经过加工或与烟叶等混在一起，导致从形态上无法识别。对于大麻化学成分的分析，多采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法检测生物检材中是否含有THC 并确定其含量，但GCMS 法分析大麻化学成分需要大量的样本，且样本必须是新鲜的，因为在陈旧样本中THC 很容易被氧化[2]。此外，THC 的含量会受大麻植株的年龄、大小以及种植环境影响[3]。

随着分子生物学技术的快速发展，在DNA 水平上对物种进行鉴定成为一种新的技术手段。DNA 条形码技术是针对特定物种筛选出短而标准的DNA 片段作为标记来实现快速、准确、自动化的物种鉴定[4]，该技术一经提出就被广泛应用于动物、植物及微生物的物种鉴定。rbcL 序列作为鉴定陆生植物的通用条形码之一[5]，由编码区与非编码区组成，非编码区具有高度保守序列，有助于通用引物的设计。同时，rbcL序列在GenBank 数据库中拥有大量不同物种的数据，这使得检测后的序列比对有据可依。FAZEKAS 等[6]采用4 对引物对251 个样本进行rbcL 全序列测定分析，发现扩增及测序成功率可达100%，但rbcL 序列全长约1 400 bp，实验繁琐，数据分析工作量大，因此KRESS 等[7]建议选取rbcL 部分序列作为DNA 条形码进行物种鉴定。许贞等[8]基于rbcL 部分序列对天南星药材及其常见混伪品进行鉴定，结果表明，rbcL 部分序列可以对天南星及其混伪品快速、准确地鉴别。

YANG 等[9]研究表明，大麻与葎草属亲缘关系最近，为评估rbcL 序列的鉴别能力，本研究收集了大麻及葎草属（Humulus）植物样本，扩增并测定叶绿体DNA rbcL 序列中628～1 361 bp 片段[10]，对测定序列进行BLAST 相似性检索，并与GenBank 数据库下载的大麻科植物的rbcL 序列进行遗传距离、中介网络与系统聚类分析，旨在对rbcL 序列的检测及鉴别性能进行评估，判断其是否适宜成为鉴定大麻的遗传标记。

1 材料与方法

1.1 样本

检测样本：本研究共收集来自62 份大麻、10 份啤酒花（Humulus lupulus）、10份葎草（Humulus scandens）的叶片组织。其中大麻样本（编号为DM001～DM062）由司法鉴定科学研究院法医毒物化学研究室提供，经GC-MS 法检测为大麻；葎草属的2 个物种啤酒花（编号为HL01～HL10）和葎草（编号为HS01～HS10）分别购自新疆和安徽。

数据样本：从GenBank 数据库中下载大麻科10 个属[9]48 个物种的rbcL 序列，每个物种选择1～4 条序列，共筛选出96 条序列（附表1）。为了比较不同地区大麻rbcL 序列间的差异，从GenBank 数据库中下载6 条产自不同地区的大麻rbcL 序列（JN040400、JN040401、AJ390068、AJ402933、AF500344、KF250351）。

1.2 DNA提取与定量

针对检测样本，取30 mg 风干叶片组织，用75%乙醇溶液和超纯水洗涤数次，加入液氮充分研磨后，采用DNeasy Plant Pro 试剂盒（德国Qiagen 公司）进行DNA 提取，具体步骤参照试剂盒操作说明书，并用Epoch 超微量微孔板分光光度计（美国BioTek 公司）测定DNA 的纯度及浓度。

1.3 PCR扩增与测序

采用rbcL 序列通用引物[9]进行DNA 扩增，其中正向引物序列为：5′-CCATTYATGCGTTGGAGAGA TCG-3′；反向引物序列为：5′-TCAGGACTCCACTTA CTAGCTTCACG-3′。构建及优化后的PCR 反应体系为15 μL，包含：2×Multiplex PCR Master Mix 7.5 μL，5×Q-Solution 1.5 μL，去离子水4 μL，正、反向引物混合物（10 μmol/L）1 μL，模板DNA（1 ng/μL）1 μL。PCR 反应在9700 型PCR 仪（美国Applied Biosystems公司）上进行，优化后的PCR 扩增条件为：95 ℃预变性15 min；94 ℃变 性30 s，53 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共30 个循环；60 ℃终延伸60 min。PCR 产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，选取在预期位置上出现的单一、清晰、明亮、无拖尾的条带，纯化回收后将测序产物在3730xlDNA 测序仪（美国Applied Biosystems 公司）上进行双向Sanger 测序。

1.4 数据处理

使用DNAMAN v6.0 软件（美国Lynnon Biosoft 公司）及Chromas Lite v2.01 软件（澳大利亚Technelysium 公司）对测序峰图进行校对拼接，去除低质量序列及引物区，获得rbcL序列信息。基于NCBI中BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行核酸序列相似性检索，采用MEGA X 在线软件（https://www.megasoftware.net/）进行序列比对及变异位点分析，对大麻科96 条序列进行多重比对，同时基于Kimura-2-Parameter（K2P）模型计算种内及种间遗传距离，运用中介邻接网络（median-joining network，MJ）法构建中介网络图，并基于邻接法（neighbourjoining，NJ）构建系统聚类树，同时以bootstrap（自展支持率1 000 次）重复检验各分支的支持率。

2 结果

2.1 扩增结果

经琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA Ladder 2000（中国Novoprotein 公司）为分子量标准，82 份样本的扩增产物长度均在500～750 bp，且条带单一、清晰、明亮、无拖尾，表明82 份样本的rbcL 序列扩增成功率为100%。

2.2 大麻序列分析

2.2.1 BLAST比对

对扩增产物进行Sanger 测序，62 份大麻样本测序所得序列长度均为617 bp，仅在90 bp 处发现一个单一多态性变异位点。20 份葎草属样本测序所得序列长度均为649 bp，其中10 份啤酒花rbcL 序列完全一致，无变异位点；10 份葎草rbcL 序列也完全一致，无变异位点。

将测序所得的大麻rbcL 序列进行BLAST 相似性检索，与GenBank 数据库中大麻的rbcL 序列（MH118118、KY419963、JN040400、MW013540、KY084475、KT458035、KR779995、KR184827、NC_027223和NC_026562）相似性为100%。啤酒花和葎草样本的BLAST 检索结果显示其属于葎草属，其中测序所得的啤酒花rbcL 序列与GenBank 数据库中啤酒花的rbcL序列（MG573060、KT266264、KM360825）相似性为100%，测序所得的葎草rbcL 序列与Gen-Bank 数据库中葎草的rbcL 序列（KC539684）相似性为100%。结果表明，通过对rbcL 序列进行BLAST 相似性分析可以初步鉴定大麻及葎草属样本。

2.2.2 变异位点分析

62 例大麻样本测序所得rbcL 序列与从GenBank数据库中下载的6 条产自不同地区的大麻rbcL 序列（JN040400、JN040401、AJ390068、AJ402933、AF500344、KF250351）进行比对，共发现2 个单一多态性变异位点（分别在90 bp 和350 bp 处）。由于叶绿体DNA 常被看作是独立的遗传单位，在细胞分裂时很少发生重组[11]，因此根据这2 个变异位点划分了3 种单倍型，分别命名为Haplotype A（HA）型、Haplotype B（HB）型和Haplotype C（HC）型（表1）。本研究大麻样本中共检测到2 种单倍型，其中HA 型57 例（91.94%），HB 型5 例（8.06%），未检测到HC 型。下载的6 条序列中，源自中国的大麻样本为HB 型，英国和美国的大麻样本均为HC 型，巴西的大麻样本为HA 型。

表1 大麻变异位点与单倍型Tab.1 Variation sites and haplotypes of Cannabis sativa L.

2.3 大麻与大麻科其他物种间的序列分析

2.3.1 遗传距离分析

通过对62 份大麻样本测序所得序列和从Gen-Bank 数据库中下载的大麻科96 条序列进行分析，并使用MEGA X 软件选择K2P 模型计算种内及种间遗传距离。结果（附表2）显示，大麻种内不同样本的遗传距离为0～0.004 9，而大麻与其他92 个非大麻物种之间的最小遗传距离为0.012 9（大麻与啤酒花），即大麻的最小种间遗传距离大于种内遗传距离。此外，属间遗传距离（表2）显示，大麻属与葎草属的遗传距离最小，为0.016 7，表明与其亲缘关系最近。

表2 大麻科属间的K2P遗传距离Tab.2 K2P genetic distance between genera of Cannabaceae

2.3.2 中介网络分析

基于大麻科不同物种间的碱基变异位点，本研究运用中介邻接网络法构建中介网络图，用于显示序列信息并评估rbcL 序列鉴别大麻的能力。由图1 可以看出，大麻可以很好地与其他大麻科物种进行分离，包括与大麻亲缘关系最近的葎草属，且大麻样本也明显地分为3 个小群，这与变异位点分析中将不同大麻样本划分为3 种单倍型（HA 型、HB 型和HC 型）的结果相吻合。

2.3.3 系统聚类树分析

基于大麻科96 条rbcL 序列，通过邻接法构建系统聚类树。如图2 所示，构建的系统聚类树主要分为7 支，大麻与葎草属聚为一支，在该分支中大麻与葎草属各自聚成一个单系群（bootstrap 99%），表明尽管大麻与葎草属亲缘关系最近，但rbcL 序列能够将大麻与葎草属进行有效区分。上述结果表明，rbcL 序列可用于大麻及其他大麻科物种间的鉴别。

图2 基于rbcL序列构建的大麻科系统聚类树Fig.2 System clustering tree of Cannabaceae based on rbcL sequence

3 讨论

目前，大麻常规的鉴定方法为利用GC-MS 法检测植株内THC 含量是否高于0.5%[12]。然而，大麻植株在不同的发育阶段及受到光照时间、环境温度、土壤湿度等环境因子的影响，其植株内的THC 含量会发生改变[13]，并且THC 在陈旧样本中很容易被氧化导致THC 含量降低，这些因素增加了利用GC-MS 法对大麻进行成功鉴定的困难。DNA 条形码技术作为一种新的分子鉴定技术，与传统的物种鉴定方法相比，具有准确性高、效率高以及不受环境、个体发育和人为因素影响等优势，已被广泛应用于动植物以及微生物的物种鉴定。宋炳轲等[14-15]利用psbA-trnH 和ITS2序列对大麻及其混伪品进行鉴别，结果显示，psbAtrnH 和ITS2 序列可以准确地鉴别大麻及其混伪品。

目前业内广泛认为rbcL 序列相比于其他条形码具有易于扩增及测序的优点[16]，适用于物种鉴定，而国内对于大麻rbcL序列的研究较少。本研究设计的检测体系可对大麻及葎草属样本中rbcL序列进行成功扩增。将测序获得的大麻rbcL 序列进行BLAST 相似性检索，结果显示，本研究中的大麻测序数据与GenBank数据库中收录的部分大麻的rbcL 序列相似性高达100%，可初步确定62 份实验检材均为大麻样本。

本研究从GenBank 数据库中筛选了96 条大麻科rbcL 序列（来自10 个属48 个物种），其中的4 条大麻rbcL 序列包含了2.2.2 节所述3 种单倍型。对96 条大麻科rbcL 序列进行遗传距离分析，结果显示，大麻种内不同样本间最大遗传距离为0.004 9，小于大麻与非大麻物种之间的最小遗传距离（0.012 9，出现在大麻与啤酒花之间），表明rbcL 序列有足够的序列差异性来区分大麻与大麻科其他物种，证明了rbcL 序列鉴别大麻及其近缘物种的可行性。中介网络分析也显示了相同的结果。基于系统聚类树的分析显示大麻与葎草属聚为一支，表明大麻与葎草属亲缘关系最近，这与2.3.1 节中大麻与葎草属的遗传距离最小相吻合。尽管大麻与葎草属亲缘关系最近，系统聚类树结果显示rbcL 序列仍然可以准确地将大麻与葎草属区分开，这为在实践中依据rbcL 序列区分大麻与葎草属提供了可能。

此外，本研究对产自中国、英国、美国和巴西4 个地区的大麻样本进行了序列分析，发现在2 个位置上出现了单一多态性变异位点，总计3 种单倍型，其中源自中国的大麻单倍型为HA 型和HB 型，英国与美国大麻具有相同的单倍型HC 型，巴西大麻单倍型为HA 型，进一步研究大麻产地与单倍型之间的关系将有助于跨国贩毒案件的追踪与调查。

综上所述，本研究基于rbcL序列对大麻进行鉴定，结果表明，基于rbcL 序列所构建的BLAST 相似性检索联合系统聚类树法，可为法医学大麻种属鉴定提供一种可靠、便捷的检测手段，有助于警方打击贩毒集团及个人。rbcL 序列可以作为鉴定大麻的DNA 条形码，今后仍需要收集更多地区的大麻进行研究，扩充数据库，使不同地区贩毒案件的毒源追踪成为可能。