pH-磁双响应Janus笼

纪旭阳， 张 杨， 梁福鑫

（1. 航天特种材料及工艺技术研究所，北京 100074；2. 清华大学化学工程系，高分子研究所，北京 100084）

Janus材料的不对称结构和化学组成使其呈现出独特性能[1-5]。具有中心对称结构的Janus笼，其内外表面化学组分有着严格的分区，因此可以利用表面浸润性差异对目标物质进行选择性富集[6]。Chen等[7]将具有温度响应性的聚合物接枝于Janus笼内部，通过调节环境温度，实现了对油溶性物质的富集以及可控释放。Zhao等[8]以pH响应性聚合物Janus笼作为药物载体，在不同的pH条件下，实现了油溶性药物阿霉素（DOX）的可控装载及释放。

相较于有机聚合物，无机物壳层的Janus笼的结构稳定性及生物惰性更好。本文对磁性颗粒内外表面进行了改性，分别将具有良好靶向性的叶酸基团[9,10]和具有pH响应性的聚合物[11,12]接枝于介孔壳层的内外表面，通过调节环境的pH实现对油溶性物质的选择性富集和释放。根据前期工作[13]，我们制备了磁性介孔二氧化硅（Fe3O4@mSiO2）颗粒，进一步通过溶胶-凝胶反应在表面接枝羧基基团，再通过羧基与氨基的缩合反应将具有良好靶向性的叶酸（FA）修饰的聚乙二醇（PEG-FA）接枝于Fe3O4@mSiO2外侧，得到了Fe3O4@mSiO2@PEGFA颗粒。抽提除去制孔模板十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）后，利用稀盐酸对Fe3O4内核进行部分刻蚀，得到Yolk-Shell结构的磁性Janus笼。通过带双键的硅烷偶联剂对介孔二氧化硅壳层内侧进行改性后，利用自由基聚合在二氧化硅壳层内侧接枝聚甲基丙烯酸二乙氨基酯（PDEAEMA），得到外侧是PEG-FA修饰、内侧是PDEAEMA修饰的pH-磁双响应Janus笼。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

三氯化铁（FeCl3·6H2O）、乙二醇、正硅酸乙酯（TEOS）、聚乙二醇（PEG）、乙酸钠（CH3COONa）、CTAB、盐酸阿霉素（DOX·HCl）：分析纯，国药试剂公司；甲基丙烯酸二乙氨基酯（DEAEMA）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）：化学纯，TCI公司；偶氮二异丁腈（AIBN）：化学纯，百灵威公司；氨基聚乙二醇叶酸（NH2-PEG-FA）：分析纯，Mn, PEG=5.0×103，西安凯新生物科技有限公司；三乙氧基硅基丙基马来酸：w=95%，Sigma-Aldrich公司；3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（MPS）：w=95%，Alfa Aesar试剂公司。

1.2 测试与表征

扫描电镜（SEM）：样品经冷冻干燥后真空镀铂，通过Hitachi S-4800型场发射扫描电镜观察微观形貌，加速电压15 kV；透射电镜（TEM）：样品经乙醇分散后滴于超薄碳膜，干燥后通过JEOL-JEM-100 CX 型透射电镜对其结构进行观察，加速电压100 kV；傅里叶红外光谱（FT-IR）：Bruker Equinox 55 FT-IR型红外光谱仪；热失重分析（TGA）：PerkinElmer Pyris 1型TGA仪，空气气氛，升温速率为10 ℃/min；激光共聚焦显微镜（CLSM）：激光共聚焦显微镜（Leica TCS-sp 2）；紫外-可见光谱（UV-Vis）：普析通用TU 1901型。

1.3 实验步骤

1.3.1 Fe3O4@mSiO2颗粒的制备将2.36 g FeCl3·6H2O，1.75 g PEG（Mw=2.0 × 104），3.14 g CH3COONa加入到70 mL乙二醇中，在水热釜中200 ℃下反应8 h后洗涤3次，得到黑色Fe3O4纳米颗粒（Fe3O4NPs）。取0.3 g Fe3O4NPs，0.45 g CTAB加入到525 mL去离子水中并使其完全分散。随后依次加入25 mL乙酸乙酯和15 mL氨水（w=30%），超声2 h后加入0.525 g TEOS，室温下反应8 h后，在磁场下将产物分离，洗涤3次后真空干燥，得到黑色Fe3O4@mSiO2颗粒。

1.3.2 PEG-FA修饰的磁性介孔二氧化硅（Fe3O4@mSiO2@PEG-FA）颗粒的制备取100 mg Fe3O4@mSiO2颗粒分散于50 mL乙醇中，随后向其中加入50 mg三乙氧基硅基丙基马来酸，70 ℃下反应12 h后，磁场下使产物分离，用乙醇洗3次后真空干燥，得到羧基修饰的磁性介孔二氧化硅（Fe3O4@mSiO2@-COOH）颗粒。取100 mg Fe3O4@mSiO2@-COOH颗粒分散于50 mL DMSO中，加入20 mg EDC和20 mg NHS，室温搅拌24 h。随后加入20 mg NH2-PEG-FA，室温搅拌24 h，得到Fe3O4@mSiO2@PEG-FA颗粒。

1.3.3 pH-磁双响应Janus笼的制备取100 mg Fe3O4@mSiO2@PEG-FA颗粒分散于20 mL无水乙醇中，加入1 mL 2 mol/L盐酸后在70 ℃下反应2 h，对Fe3O4内核进行部分刻蚀，得到蛋黄-蛋壳结构Janus笼。随后将Janus笼分散于乙醇中，向其中加入一定量的MPS，70 ℃下反应12 h后在磁场下使产物分离，洗涤3次后真空干燥，得到外侧是PEG-FA修饰，内侧是双键修饰的Janus笼。取上述Janus笼20 mg分散于10 mL甲苯中，再加入5 mg AIBN和20 mg DEAEMA，氮气气氛70 ℃下反应8 h，得到外侧是PEG-FA，内侧是PDEAEMA修饰的pH-磁双响应Janus笼（图（1））。

图1 pH-磁双响应Janus笼的合成：（a）外侧修饰羧基的Fe3O4@mSiO2颗粒；（b）外侧由PEG-FA基团修饰的“蛋黄-蛋壳”结构磁性Janus笼；（c）pH-磁双响应Janus笼Fig. 1 Preparation of pH and magnetic responsive Janus cages: （a）Fe3O4@mSiO2 particles with carboxyl modified on external surface;（b）Magnetic “yolk-shell” Janus cages with PEG-FA groups modified on external surface; （c）pH and magnetic responsive Janus cages

1.3.4 pH-磁双响应Janus笼的载药实验在20 mL一定浓度DOX·HCl的DMF溶液中加入0.05 g三乙胺，室温下搅拌12 h。将20 mg pH-磁响应Janus笼加入到20 mL DMF中，分散后在前述DOX溶液中搅拌12 h。分离后加入pH为7.4的PBS缓冲溶液重新分散。测定其在480 nm处的荧光强度，进一步利用DOX的释放标准曲线计算得到DOX的浓度，载药率（E）公式为：

其中：mDrug为DOX的装载质量；mCages为Janus笼的质量。

1.3.5 DOX的体外释放将装载了DOX的Janus笼分别分散于pH为7.4和6.5 的PBS，以及pH为5.5的醋酸缓冲溶液中。Janus笼的质量浓度为1 mg/mL，放入15 mL PBS或醋酸缓冲溶液中，37 ℃下匀速搅拌。每隔一段时间，取样5 mL进行荧光强度检测，同时补充5 mL相应溶液，以保持液体总量不变。释放量（Er）公式为：

其中：mDOX为Janus笼中DOX的质量；cn为第n个样品的DOX浓度；样品溶液的原始体积V0为20 mL；Ve为每次取样溶液的体积，Ve=5 mL。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4@mSiO2颗粒的表征

图2为Fe3O4纳米颗粒的SEM及TEM照片。结果显示：所制备颗粒尺寸较为均一，约为200 nm（图2（a, b））。以CTAB为制孔模板，在Fe3O4纳米颗粒表面覆盖一层介孔二氧化硅，得到的Fe3O4@mSiO2颗粒介孔层厚度约为20 nm（图2（c, d））。Fe3O4纳米颗粒以及Fe3O4@mSiO2颗粒的XRD表征结果见图3，两种样品颗粒晶型均与PDF-2标准卡片89-0691一致。

2.2 Fe3O4@mSiO2@PEG-FA颗粒的表征

由图4中改性前的Fe3O4@mSiO2颗粒，与改性后的Fe3O4@mSiO2@-COOH颗粒的FT-IR谱图可见，改性后，1700 cm−1处出现了―COOH的红外特征峰。Fe3O4@mSiO2@PEG-FA的FT-IR图中，1700 cm−1处的羧基特征峰显著增强。同时，UV-Vis光谱对FA的接枝表征结果显示（图5），Fe3O4@mSiO2@PEG-FA颗粒在277 nm处出现了FA的紫外特征吸收峰。TGA的结果显示（图6），PEG-FA的接枝量为2.5%。

图2 Fe3O4纳米颗粒的（a）SEM和（b）TEM照片；Fe3O4@mSiO2颗粒的（c）SEM和（d）TEM照片Fig. 2 （a）SEM and （b） TEM images of Fe3O4 NPs; （c）SEM and （d）TEM images of Fe3O4@mSiO2 particles

图3 样品的XRD光谱Fig. 3 XRD patterns of samples

图4 样品的FT-IR谱图Fig. 4 FT-IR spectra of samples

图5 样品的UV-Vis曲线Fig. 5 UV-Vis curves of samples

图6 样品的TGA曲线Fig. 6 TGA curves of samples

2.3 Janus笼的表征

图7为Janus笼的SEM和TEM照片。盐酸乙醇溶液刻蚀之后，磁性介孔二氧化硅颗粒的外部形貌（图7（a））得以保持，而内部（图7（b, c））因部分Fe3O4内核被刻蚀出现空腔，且保持了原有的磁性。

图7 Janus笼的 （a）SEM和 （b, c）TEM照片Fig. 7 （a） SEM and （b, c）TEM images of the Janus cages

FT-IR数据证明Janus笼在1550 cm−1处出现了PDEADMA的特征峰（图4）。图6中的TGA结果显示，PDEADMA的接枝量为39.2%。利用PMMA对Janus笼进行包埋，在室温下对样品进行超薄切片，其切片样品的TEM表征结果见图8。结果显示，PDEAEMA完全接枝于Janus笼内侧。

图8 接枝PDEAEMA（a）前、（b）后的Janus 笼的TEM照片Fig. 8 TEM images of Janus cages （a）before and （b） after grafting the PDEAEMA

2.4 Janus笼的pH响应性

Janus笼具有pH响应性。在水中加入一定量的正己烷，其中加入少量油溶性染料Dil-C18，以便区分油水两相（图9（a1））。然后，向该两相体系中加入一定量Janus笼，通过加入少量的NaOH溶液调节体系pH至8（图9（a2））。在此条件下，Janus笼内侧的PDEAEMA由于去质子化而表现疏水状态，从而可实现Janus笼对正己烷的选择性富集（图9（a3））。通过加入少量的盐酸，调节体系的pH至5，由于Janus笼内侧的PDEAEMA在该条件下表现出亲水性，被富集装载在空腔内的正己烷则被释放（图9（a4））。

Janus笼在pH=8时从水中选择性富集正己烷，在激光共聚焦显微镜下，装载了正己烷的Janus笼呈绿色（图9（b）），而当pH=5时，Janus笼的荧光消失（图9（c）），说明正己烷被释放出Janus笼。

2.5 Janus 笼的载药实验

不同DOX浓度下Janus 笼的载药率见表1。在一定范围内，Janus 笼中空球载药率随着DOX含量的增加而升高，而当DOX含量增加到一定程度后，载药率趋于稳定。

Janus笼分别在pH=5.5，6.5，7.4的环境下对DOX的释放曲线见图10。当pH=5.5时，DOX释放量可占到载药量的75%；当pH=6.5时，DOX释放量下降，约为58%；而当pH=7.4时，DOX释放量最少，约为35%。相较于正常生理体系的中性环境，处于癌症病变的生理体系呈弱酸性，由此证明，所制备pH-磁响应性Janus笼在正常生理环境下药物释放较少，而在癌症病变的弱酸性环境下，可实现响应性药物释放。

图9 Janus笼的pH响应性：（a1）正己烷（上层）-水（下层）两相体系，正己烷中加入显色剂dil-C18；（a2）在pH=8条件下加入20 mg Janus笼；（a3）正己烷因被Janus笼富集而从水相中分离；（a4）在pH=5条件下，Janus笼将正己烷释放；（b）在pH=8条件下，装载了正己烷的Janus笼和（c）在pH=5条件下，Janus笼将正己烷释放后的激光共聚焦显微镜照片Fig. 9 pH responsive of the Janus cage:（a1）Immiscible mixture of hexane （top） and water（bottom）, dil-C18 was added in hexane as the chromogenic agent；（a2）after adding the Janus cage in the mixture under stirring at pH 8; （a3）magnetic collection of the Janus cage at pH 8; （a4）triggered release of hexane from the Janus cage at pH 5; fluorescence microscopy images of （b） the Janus cage filled with hexane at pH 8 and （c） after release of oil at pH 5

表1 不同DOX含量下Janus笼的载药率Table 1 Drug loading capacity of Janus cages at different content of DOX

图10 装载DOX的Janus笼的药物释放曲线Fig. 10 Drug release profiles of DOX-loaded Janus cages

3 结 论

（1）亲水基团PEG-FA和响应性的聚合物PDEAEMA分别修饰于Fe3O4@mSiO2颗粒介孔内外表面，得到了Janus笼。

（2）Janus笼可实现对油溶性物质的选择性富集及可控释放。

（3）在弱碱性条件下实现了Janus笼对油溶性药物DOX的装载。

（4）初步验证了Janus笼在靶向药物输送及肿瘤区域可控释药领域应用的可行性。