含二硒聚碳酸酯自组装胶束的制备及其性能

马晓宁， 周 沉， 郎美东

（华东理工大学材料科学与工程学院，上海 200237）

聚碳酸酯由于其生物相容性、低毒性和可生物降解性在生物材料中应用广泛[1,2]。通过将含有不同官能团单体的碳酸酯聚合，可以得到满足不同需求的各种功能化聚碳酸酯[3]。为了获得刺激响应型聚碳酸酯，许多刺激响应基团，如pH[4]、温度[5]、光[6,7]、电子[8]、氧化还原响应等[9,10]被引入到聚合物链中。

硒元素（Se）最早发现于1817年[1]，是14种机体必需的微量元素之一。硒的化学活性和物理性质类似于同族的硫和碲[2]，但与同族的硫族元素（S）相比，硒元素原子半径更大、电负性更低。二硒醚键是一种低结合能（172 kJ/mol）的动态化学键，在外界刺激下会发生复分解反应或断裂。含二硒醚的聚合物因其在温和的氧化还原、光照和辐照下的特异性刺激响应性而在纳米技术和生物化学领域备受关注[11,12]，将二硒的响应氧化-还原特性与可降解聚合物相结合，通过控制二硒键的含量调整材料的刺激响应能力，可开发新的刺激响应材料。含二硒的生物聚合物材料由于缺乏有效的合成策略，一直发展缓慢[13]，直到2010年，Xu等[14,15]报告了一种含有二硒醚的聚氨酯及其在药物载体上的应用，随后Ma等[16]也报道了二硒嵌段共聚物在温和还原条件下的反应。目前大多数硒聚合物是通过逐步聚合和自由基聚合的方法合成的，逐步聚合反应可控性较差，得到的硒聚合物往往呈宽分子量分布，若硒或二硒键不存在于聚合物重复单元内则硒含量难以提高；而自由基聚合以引发剂或偶联剂的方式将硒引入聚合物链，且硒多以单硒键形式存在，因而难以调节硒含量，并且限制了以二硒键形式发挥化学特性的可能，所用单体多为乙烯基类，在单体的选择上也受很大的限制。开环聚合（ROP）合成的聚合物通常结构清晰、相对分子质量可控、分散性低，通过调节单体能够控制硒含量，可以克服自由基聚合和逐步聚合的弱点[17,18]，为合成二硒醚聚合物提供了一种可靠的策略。

本文利用实验室开发的可用于ROP的含硒环状碳酸酯单体，与普通碳酸酯单体进行“一锅法”投料，通过调整配比进行聚合，得到了分子量适宜、分子量分布窄、硒含量可调、结构明确的两亲性功能化含二硒聚碳酸酯（mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC））。使用透析法、薄膜分散法、超声乳化法制备了含二硒聚碳酸酯的胶束，从粒径及粒径分布和药物包载等方面考察这3种胶束制备方法的优劣，并通过药物释放实验初步验证了含二硒聚碳酸酯胶束的刺激响应性释药能力。这些研究为含二硒聚合物的合成以及胶束制备的方法累积了经验，也为其后续作为药物载体的研发奠定了扎实基础。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

溴乙醇、硼氢化钠（NaBH4）、硒粉、四氢呋喃（THF）、二氯甲烷、氘代二氯甲烷（CDCl3）、碳酸二苯酯、三亚甲基碳酸酯（TMC）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、芘、谷胱甘肽（GSH）、5-氟尿嘧啶（5-FU，w=99%）：分析纯，上海泰坦科技有限公司；聚乙二醇单甲醚（mPEG）：Mn=2 000，Sigma Aldrich；甲苯（钠回流蒸馏干燥后使用）和乙醚：分析纯，国药试剂有限公司；脂肪酶（Lipase CA）：Novozym435，南京诚纳化工有限公司，真空干燥48 h。

1.2 测试与表征

核磁共振氢谱（1H-NMR）：德国Bruker AV400，氘代氯仿为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标；凝胶渗透色谱（GPC）：美国Varian PL-GPC 50 Plus，流动相为含0.01 mol/L溴化锂的N,N-二甲基甲酰胺，检测器温度35 ℃，流速1 mL/min，标样为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）仪：美国Thermo Scientific Nicolet is50，溴化钾压片法制样，波长范围400～4 000 cm−1；动态光散射（DLS）仪：英国Malvern ZEN 3700，测试温度25 ℃，波长设定633 nm；透射电子显微镜（TEM）：日本JEM 1400；扫描电子显微镜（SEM）：日本日立S4800；荧光分光光度计：美国 Perkin Elmer LS-55 Lumine；紫外分光光度计：上海精科UV-Vis 765，测试温度25 ℃，测定5-FU的吸光度，建立样品浓度与吸光度关系的标准曲线，根据测得样品的吸光度换算药品浓度，波长为0～600 nm，测得5-FU的DMF溶液吸收波长为275 nm。载药量（DL）和包封率（EE）按式（1）、（2）进行计算。

其中：m0为聚合物载体的质量；m1为包载药物的质量；m2为投入药物的总质量。

1.3 实验步骤

1.3.1 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的合成含二硒聚碳酸酯的合成路线如图1所示。将2.0 g硼氢化钠溶解于100 mL水中，加入4.0 g硒粉充分溶解后加热至80 ℃反应2 h，将6.3 g溴乙醇溶解于80 mL THF后加入到体系中，50 ℃下反应6 h后，所得溶液用二氯甲烷萃取有机相，通过柱层析法提纯后得到2,2′-二硒二乙醇。取合成的2,2′-二硒二乙醇1.7 g、碳酸二苯酯1.5 g及脂肪酶1.1 g于500 mL反应瓶中，加入400 mL新鲜无水甲苯于70 ℃下反应12 h后过滤除去脂肪酶，旋蒸除甲苯溶剂，所得固体产物通过柱层析法提纯得到大环二硒乙醇碳酸酯单体MSeSe。将10 mL反应瓶抽烤3次后，在氩气保护下加入mPEG 20 mg，MSeSe单体27.5 mg和TMC 61.2 mg，加入脂肪酶8.9 mg催化反应，以2 mL新鲜无水甲苯为溶剂，70 ℃反应24 h后过滤除去酶，由二氯甲烷稀释并在乙醚中沉降获得共聚物。不同嵌段组分共聚物的合成通过改变mPEG、MSeSe和TMC的投料摩尔比来调整。

mPEG用量为1 mol，投料比n (MSeSe)∶n(TMC)=1∶55、3∶44、5∶33的聚合物分别记作P1、P2、P3。

图1 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的合成路径Fig. 1 Synthesis routine of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）

1.3.2 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）胶束的制备（1） 透析法：称取聚合物25.5 mg和适量5-FU充分溶解于2.5 mL DMF中，将溶液缓慢滴入15 mL蒸馏水中，在800 r/min下搅拌3 h使有机相充分分散于水相，然后转移入截留分子量3 500的透析膜中以去离子水为外液相进行透析[19]。定时更换外液相的水，更换次数不少于6次，每次间隔时间不低于6 h。透析完成后收集全部内液相并定容，得到mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的5-FU载药胶束。空白胶束不加药物以同样方法制得。

（2） 薄膜分散法：称取聚合物 25.5 mg溶解于2.5 mL二氯甲烷中，充分溶解后装进圆底瓶，中速旋蒸使有机溶剂二氯甲烷完全挥发，聚合物在烧瓶底均匀铺开形成聚合物薄膜。加入蒸馏水25 mL，在 50 ℃水浴中速搅拌5 h使聚合物薄膜充分分散到水相中[20]，形成的水溶液质地均匀并散发标志性蓝光，定容后得mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的空白胶束。

（3） 超声乳化法：称取聚合物 25.5 mg溶解于2.5 mL二氯甲烷中，充分溶解后加入20 mL蒸馏水，将超声探头置于水油分界面进行超声，功率250 W，每超声60 s间歇15 s为1周期，进行4周期。过程中适当调整探头位置使有机相充分被超声分散于水相[21]。超声后混合液从水油分界的体系变为均一的乳液体系，旋蒸去除有机溶剂后体系变为散发标志性蓝光的胶束溶液，定容后得mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的空白胶束。

1.3.3 临界胶束浓度（CMC）的测定采用芘荧光探针法来测定CMC以判断聚合物自组装成胶束的能力，具体操作如下：配制浓度为6.0×10−6mol/L的芘的丙酮溶液，向每个10 mL规格的棕色容量瓶内用移液枪加入1 mL溶液，将所有加入了溶液的棕色容量瓶置于 40 ℃烘箱中静置过夜使丙酮完全挥发，芘留在瓶内在底部形成薄膜。将配制好的浓度为0.1～1×10−4mg/mL的一系列空白胶束溶液分别加入到容量瓶中并定容。将装有胶束溶液和芘的容量瓶密封好，置于恒温振荡箱内在37 ℃下孵育12 h使芘充分分散并进入胶束疏水内核。使用荧光分光光度计测试配制好的系列胶束溶液，以荧光强度（I）的比值I337/I333对浓度作图，突变点前后切线的交点对应CMC。

1.3.4 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）@5-FU胶束的响应性取一定量空白胶束溶液加入30 mmol/L GSH搅拌使其反应，隔一定时间取胶束溶液测定粒径表征形貌，反应48 h后制样通过透射电镜观察形貌。

1.3.5 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）@5-FU胶束的体外释药分别以pH=7.4的磷酸缓冲盐溶液（PBS）、含浓度为2、10 mmol/L和30 mmol/L GSH的PBS缓冲液为外液相。取5 mL载药胶束于截留分子量3 500的透析膜内并封紧袋口，置于25 mL外液相中，在温度为37 ℃、振荡频率为100 r/min的恒温振荡箱中持续48 h释药。每间距一定时间取出外液相3 mL并增补3 mL新鲜缓冲液。取出的溶液通过紫外分光光度计测定5-FU的浓度。

2 结果与讨论

2.1 共聚物的合成及表征

mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）是一种主链官能化的碳酸酯，它是先通过小分子与DPC的分子间成环反应制备出大环的二硒碳酸酯单体MSeSe，再通过mPEG引发MSeSe与普通的非官能化碳酸酯TMC的开环共聚得到聚合产物，通过控制引发剂和两种单体的投料比，可以在适合的分子量内调整聚合物的官能化嵌段比例。mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的核磁共振氢谱和硒谱分别如图2所示。由1H-NMR谱可见，PTMC链段在化学位移4.23和2.04处分别对应两种化学环境的氢出现了3重峰和5重峰；含硒链段则在4.41和3.16处出现了两种氢的质子信号峰。硒谱出现Se的单信号峰同样证实了硒的化学环境[16]。

图2 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的核磁共振谱图Fig. 2 NMR spectra of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）

通过调整投料比合成的不同官能化嵌段比例的共聚物的相对分子质量表征如表1所示。从表中可以看出，设计的共聚物嵌段比（Designed）与实际得到的嵌段比（Composition）基本符合，表明通过控制MSeSe与TMC的投料比可以有效控制共聚物的组成与硒含量，且合成的共聚物具有1.2～1.3的窄分子量分布，共聚物相对分子质量的均一性较好。

2.2 胶束的制备与表征

通过3种配比的mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的CMC来判断其形成胶束的能力，结果示于图3中，P1、P2、P3的CMC均较低，都在0.0045 mg/mL附近，这与含二硒聚碳酸酯无支链的直链结构以及硒的强疏水性质使共聚物嵌段的疏水性变强有关，反映了共聚物本身的性质。

通过不同制备方法制得的共聚物胶束经DLS测得的粒径分布结果如图4和表2所示。图4（a）是透析法制备胶束的粒径分布图，可以看出胶束的粒径整体上比另两种方法更小，窄分布表明了粒径良好的均匀性。随着共聚物配比中硒含量的增加，胶束粒径呈逐渐变小的趋势，这可能与硒的强疏水性质有关，疏水性越强，胶束内核团聚越紧密，粒径越小。图4（b）是薄膜分散法制得胶束的粒径分布，该方法得到的粒径小而均匀，随着硒含量增加胶束粒径变小，这与透析法展现出的规律一致，但不同配比共聚物间展现出了较大的粒径差异。图4（c）是超声乳化法制备的胶束粒径，粒径更大、分布更宽，不同共聚物配比的胶束之间没有明显的粒径差异和变化趋势，制得的胶束水溶液更偏向于白色浑浊乳液状，而透析法和薄膜分散法能够制得散发标志性“蓝光”并有明显丁达尔效应的胶束溶液。这证明本文合成的含二硒聚合物不适合用超声乳化法来制备结构精确的胶束。

表1 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的分子量表征Table 1 Molecular weight characterization of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）

图3 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）胶束的CMC测算谱图Fig. 3 CMC spectra of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC） micelles

图4 不同方法制备的胶束的粒径Fig. 4 Particle size of micelles prepared from different methods

表2 DLS 测定不同方法制得胶束的粒径数据Table 2 Particle size of micelles prepared from different methods by DLS

图5为3种方法制备的胶束样品的TEM照片。如图所示，由含二硒共聚物P1制得的胶束均呈球状形貌，粒径为几十至几百纳米，这与DLS测定的粒径结果相符。值得注意的是，尺寸小于30 nm的简单胶束是通过两亲性质的自组装形成的，而尺寸大于50 nm的聚合物球状胶束被称为“大型复合胶束”，这种胶束的形成机理目前被广泛认可的一种解释为“胶束聚集体”（MMA）机制，即大的复杂胶束由小型简单胶束进行多步聚集而形成[22]。

图5 P1胶束的TEM照片Fig. 5 TEM images of P1 micelles

表3为共聚物胶束的载药量与包封率对比，总体来看胶束载药量很低，这是因为5-FU是亲水性药物，而胶束内核的碳酸酯为疏水性，药物与核的相容性较弱，经历了长时间的透析后会增加5-FU的流失。3种方法中透析法制备的胶束载药量最低，薄膜分散法最高，可见薄膜分散法制备的胶束适用于亲水药物包载。

表3 共聚物胶束的载药量与包封率Table 3 Drug loading and encapsulate efficiency of copolymer micelles

2.3 胶束的响应性与释药

图6是聚合物胶束在不同环境下的释药过程。由图可见P1、P2、P3胶束在10 mmol/L GSH条件下的药物释放行为，以及P2胶束在2 、10、30 mmol/L GSH条件下的药物释放行为。在10 mmol/L GSH中，随着P1、P2、P3中硒含量的增加，胶束对GSH的响应性逐渐增强，药物释放量逐步增加；P2胶束在不同浓度条件下，随着GSH浓度逐渐增加，胶束药物释放量逐步增加。表明了在GSH刺激条件下，胶束发生了响应性释药行为，响应性与硒含量和GSH的浓度有关。P1胶束与GSH反应前后的胶束形貌经TEM观察如图7所示。

图6 共聚物胶束的药物释放行为Fig. 6 Drug release behavior of copolymer micelles

图7 P1胶束经GSH处理12 h前（a）后（b）的TEM照片Fig. 7 TEM images of P1 micelles before （a） and after （b） dealing with GSH for 12 h

3 结 论

（1）合成了含二硒聚碳酸酯，该共聚物分子量可控、分子量分布窄，可以通过控制投料比来控制共聚物中的硒含量。

（2）透析法和薄膜分散法是适合制备含二硒聚碳酸酯胶束的方法，制备的胶束粒径在200 nm以内，其中透析法制备的胶束粒径小，而薄膜分散法操作简单高效。

（3）含二硒聚碳酸酯载药胶束能够在GSH刺激下有效释药，硒含量越高响应程度越高、谷胱甘肽浓度越高响应程度越高。