七味活络酊的制备及临床应用

艾东方 魏德红 吴 韵 邓 婷 杜 平

贵州省毕节市中医院药剂科，贵州 毕节 551700

肩关节周围炎又称肩周炎、冻结肩、五十肩等，是一种以肩臂疼痛和活动受限为主要特征的常见病。目前常用的治疗方法有口服消炎镇痛药、中药，阻滞、手术、熏洗、推拿、针灸、小针刀及功能锻炼等[1-3]，但上述方法各有利弊，往往使用范围局限，取效不佳。中药酊剂是治疗肩关节周围炎最好的药物[2,4]。因此，研究开发质量可控、安全有效的相应制剂已成为临床的迫切需求。

七味活络方是黔西北地区治疗肩关节周围炎的苗族秘方，由生扯拢、桃枝、山乌龟、细辛、草乌、豨莶草、冰片七味药组成。传统用药方法是将方中药味粉碎后，加上自酿糯米酒适量调敷患处，由于药物制备使用简单随意，患者用药后疗效差异较大。本课题组在原组方的基础上，加用适量氮酮与乙醇为辅料，采用浸渍法及溶解法制备成七味活络酊；对该制剂的性状、乙醇量、总固体等进行测定，采用薄层色谱法对方中草乌和冰片进行定性鉴别，并考察其稳定性及皮肤刺激性，以控制七味活络酊的内在质量；经用七味活络酊治疗肩关节周围炎患者，具有安全简便、起效快、疗效确切等特点。现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 FA1004电子天平(上海方瑞仪器有限公司)； AKD-310G液体相对密度、浓度测试仪(扬州艾科瑞德仪器仪表有限公司)；GC2010型气相色谱仪(日本岛津公司)。

1.2 药品与试剂 生扯拢、桃枝、山乌龟药材采自贵州省纳雍县，细辛、草乌、豨莶草、冰片饮片购自四川蜀善药业有限公司，经贵州省毕节市中医院魏德红副主任中药师鉴定均为正品。氮酮(批号：20180712，上海市瑞新化学品有限公司)；75%乙醇(批号：20190201，中科圣阳生物科技股份有限公司)；硅胶G板(批号：20170801，青岛海洋化工有限公司)；化学试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 豚鼠5只，其中雌性3只，雄性2只，体重200～250 g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。试验前2周饲养在清洁、噪声低，灯光、温度、湿度可控的房间，配备全价饲料及新鲜蔬菜，自行采食、饮水。

2 七味活络酊的检查及稳定性

2.1 七味活络酊的制备 取生扯拢40 g、桃枝30 g、山乌龟30 g、细辛40 g、草乌30 g、豨莶草30 g粉碎成粗粉，用粗粉重量4～5倍的75%乙醇作溶剂，浸渍48 h后，以2～3 mL/min速度缓缓渗漉，收集渗漉液备用；取冰片20 g及氮酮2 mL加入上述渗漉液中，搅匀使溶解，加75%乙醇调整至1000 mL，混匀，静置，滤过，即得。

2.2 七味活络酊的检查 取3批(批号：20190606、20190611、20190613)七味活络酊，检查其性状，并根据《中华人民共和国药典》[5]方法进行乙醇量、总固体、甲醇量、装量、微生物限度检查。

2.2.1 性状 将3批适量的七味活络酊分别置于无色透明玻璃容器内，进行观察、嗅闻及品尝。结果均为棕红色澄清液体，气芳香，味辛辣而清凉。

2.2.2 乙醇量 依照中国药典2015年版四部通则0711乙醇量测定法项下蒸馏法的第二法进行测定。对上述3批七味活络酊进行乙醇量测定，结果分别为64.3%、62.1%、59.7%。根据测定结果，暂定七味活络酊含乙醇量的控制标准为55%～65%。

2.2.3 总固体 依照中国药典2015年版四部通则0185酒剂项下总固体测定第二法进行测定。对上述3批七味活络酊进行总固体测定，结果分别为10.67 mg/mL、10.87 mg/mL、10.63 mg/mL。根据测定结果，暂定七味活络酊总固体的控制标准为每1 mL遗留残渣不得少于10 mg。

2.2.4 甲醇量 依照中国药典2015年版四部通则0871甲醇量检查法项下第一法进行测定。对上述3批七味活络酊进行甲醇量测定，结果分别为0.042%、0.037%、0.045%，均符合相关要求。

2.2.5 装量 依照中国药典2015年版四部通则0942最低装量检查法项下容量法进行测定。七味活络酊的标示装量为60 mL/瓶，抽取上述3批制剂进行测定，装量均未低于标示装量的97%，平均装量分别为62.1 mL、61.9 mL、62.4 mL，结果符合相关要求。

2.2.6 微生物限度 依照中国药典2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法和1106控制菌检查法及1107非无菌药品微生物限度标准检查，上述3批七味活络酊需氧菌总数分别为87 cfu/mL、62 cfu/mL、93 cfu/mL，霉菌和酵母菌总数分别为79 cfu/mL、56 cfu/mL、83 cfu/mL，且均未检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(mL)，结果符合相关要求。

2.3 七味活络酊的定性鉴别

2.3.1 草乌的薄层色谱鉴别[6]取3批七味活络酊(批号：20190606、20190611、20190613)各60 mL，分别水浴蒸至30 mL，放冷，加氨试液调pH至9～10，用乙醚提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作为不同批次供试品溶液。另按处方称取除草乌外的药材，按制备工艺制成阴性样品，同法制成阴性供试品溶液。取草乌药材粉末2 g，加氨试液2 mL润湿，加乙醚20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作为对照品溶液。按中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法，吸取上述5种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇(6.4∶3.6∶1)为展开剂，置氨蒸气饱和20分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。薄层色谱中，在与对照药材相对应的位置，不同批次供试品均显两个相同棕黄色的主斑点，阴性供试品无此斑点，说明阴性样品无干扰。如图1所示。

2.3.2 冰片的薄层色谱鉴别[7]取3批七味活络酊(批号：20190606、20190611、20190613)各10 mL，分别加乙醚7 mL，取上层溶液，50 ℃浓缩至3 mL，作为不同批次供试品溶液。另按处方称取除冰片外的药材，按制备工艺制成阴性样品，同法制成阴性供试品溶液。取冰片饮片0.2 g，加乙醇2 mL使溶解，作为对照品溶液。按中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法，吸取上述5种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(8.5∶1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃烘至斑点显色清晰。薄层色谱中，在与对照药材相应的位置，不同批次供试品均显相同颜色的斑点，阴性供试品无此斑点，说明阴性样品无干扰。如图2所示。

2.4 七味活络酊的稳定性试验 参照中药新药质量稳定性研究的技术要求[8]，将3批(批号：20190606、20190611、20190613)七味活络酊各取适量，分别置于无色透明的玻璃容器内，密封，并标识为1、2、3不同编号的供试品，室温放置，于0、1、2、3个月进行取样，按“2.2七味活络酊的检查”项下方法，观测其相关项目。结果3批供试品的性状在不同观测时间均未见变化，乙醇量、总固体也无明显改变，说明七味活络酊具有良好的初步稳定性。见表1。

表1 稳定性试验结果 (n=3)

2.5 七味活络酊的皮肤刺激性试验 参照外用药皮肤刺激性试验的研究[8]，取健康豚鼠5只，给药前24小时将其背脊左右各去毛约3 cm×3 cm(去毛后无红斑、水肿、皮损等异常)，在各豚鼠去毛皮肤左侧涂抹七味活络酊1 mL，右侧涂抹用2 mL氮酮加入75%乙醇1000 mL中制成的空白七味活络酊1 mL，二层纱布覆盖，绷带固定，24 h后除去纱布，以温水洗去左右侧残留物，观察1、24、48、72 h后皮肤刺激反应及恢复情况，与右侧比较，并按皮肤刺激反应及皮肤刺激强度评分标准进行评分与评价。结果5只豚鼠中有2只在用药后24 h观察，可见轻微红斑，1只可见轻微水肿，其他时间观察均未见异常，说明七味活络酊对豚鼠皮肤无明显刺激性。

3 七味活络酊的临床试验

3.1 诊断标准 参照《中药新药临床研究指导原则》[9]及《肩周炎》[2]相关标准制订。①患者50岁左右，常有风湿寒邪侵袭史或外伤史。②肩部疼痛及活动痛，夜间加重，可放射到手，但无感觉异常。③肩关节活动受限，以上举、前伸、外展为甚。④肩周肌肉痉挛或萎缩，肩周有广泛压痛。⑤ⅹ线及化验检查常无异常发现。

3.2 纳入标准 符合诊断标准的住院和门诊病例均入选，并对门诊病例严控可变因素；患者签署知情同意书。

3.3 排出标准[10]严重心脑疾患或脏器衰竭者；出血倾向者；颈椎病致上肢放射性疼痛者；局部软组织有炎症破损者；精神病患者。

3.4 试验设计 采用随机、双盲、安慰剂平行对照临床试验方法。按患者就诊顺序，依次交叉分别纳入治疗组和安慰剂组，由临床试验负责人保存盲底及揭盲。

3.5 样本含量 样本含量为65例，分为治疗组(七味活络酊组)33例，其中男7例，女26例；安慰剂组32例，其中男8例，女24例。两组年龄均为40～65岁。

3.6 干预措施 两组分别用七味活络酊或安慰剂涂擦患处，2～5 mL/次，3～5次/d，疗程均为7 d，期间不使用其他治疗肩关节周围炎的药物或方法。安慰剂为七味活络酊辅料加色素制成，外观与七味活络酊基本一致。

3.7 疗效评分 将涵盖各评分项目且隐去分数的肩关节周围炎疗效评定量表[11]给患者，由患者根据自己状况在相应的方框中打“?”后，交给研究者对各项目添加分数，分别对患者的日常生活能力、肩关节活动能力、肩关节疼痛程度进行评分，并计算各项目之总分。

3.8 疗效评价标准 以各项目总分作为疗效评价标准：治愈：80～100分；好转：50～80分；未愈：50分以下。

3.9 统计学方法 采用SPSS22.0软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用Wilcoxon秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3.10 两组治疗情况比较

3.10.1 总有效率比较 治疗组的总有效率明显高于安慰剂组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明七味活络酊治疗肩关节周围炎为有效的康复治疗方法。见表2。

表2 治疗组与安慰剂组临床疗效比较 (例)

3.10.2 日常生活能力评分比较 治疗组优于安慰剂组(P<0.05)，说明治疗组更能改善患者的日常生活能力。见表3

表3 治疗组与安慰剂组日常生活能力评分 (分，

3.10.3 肩关节活动功能评分比较 治疗组高于安慰剂组(P<0.05)，说明治疗组患者的肩关节活动功能得到了改善。见表4。

表4 治疗组与安慰剂组肩关节活动功能评分 (分，

3.10.4 肩关节疼痛评分比较 治疗组与安慰剂组差异有统计学意义(P<0.05)，说明治疗组减轻肩关节疼痛程度优于安慰剂组。见表5。

表5 治疗组与安慰剂组肩关节疼痛评分 (分，

3.10.5 不良反应比较 治疗组与安慰剂组均未见不良反应。

4 讨论

肩关节周围炎多发生于50岁左右的中老年人，常与外伤或受凉、肩关节慢性劳损等有关。本病属祖国医学的“痹证”范畴，年老体弱，气血虚损，风、寒、湿邪侵入关节，致局部经脉闭塞、气滞血瘀，故“不通则痛”。根据其症状演变可分为疼痛期、僵硬期及缓解期。肩关节周围炎治疗的主要目的是缓解疼痛、恢复关节活动度及缓解临床症状，以提高患者的生活质量和满意度[12]。

七味活络酊处方中生扯拢祛风除湿，桃枝活血通络，山乌龟清热解毒、散瘀止痛，细辛解表散寒、祛风止痛、通窍，草乌祛风除湿、温经止痛，豨莶草祛风湿、利关节，冰片开窍、止痛消肿。诸药合用，可以起到祛风除湿、活血通络、散瘀止痛的作用。同时，方中冰片及所用辅料氮酮和乙醇均有一定的促渗作用，能促使中药活性成分透过角质层屏障，作用于局部病灶及毛细血管，增强七味活络酊的靶向作用[4]。

本研究对七味活络酊作性状、乙醇量、总固体等检查，并采用薄层色谱法定性鉴别其中草乌和冰片，能保证制剂质量符合2015年版《中国药典》(四部)的相关要求。选用现有多种肩关节周围炎疗效评定标准中的“肩关节周围炎疗效评定量表”作为疗效评定工具，具有较为科学、客观、规范、简便等优势，能对患者的治疗效果进行较为全面的评价[11]。试验结果表明，经优化工艺制备的七味活络酊有良好的初步稳定性，对豚鼠皮肤无明显刺激，草乌、冰片鉴别薄层色谱分离效果较好、斑点显色清晰；七味活络酊用于临床，在改善患者的日常生活能力、肩关节活动功能，缓解患者的肩关节疼痛及有效率几方面，均明显优于安慰剂(P<0.05)，且未见不良反应。研究还发现，七味活络酊组33例患者首次用药后，大多即刻减轻疼痛并恢复部分肩关节活动功能，说明该制剂具有吸收快、作用迅速等特点。

综上所述，本研究对七味活络酊的制备及临床应用提供了一定的方法和证据支持，为该制剂的进一步开发利用奠定了基础。本课题组将从七味活络酊的制备工艺、质量控制标准、疗效评定标准、大样本患者的治疗效果等方面进行更深入的研究，以完善尚存不足，提高其应用性。