衰老进程中非酒精性脂肪肝病自发产生的分子机制的研究进展

刘金艳，张彬，许赛君，赵晓宏，许扬，谢勇

·综述·

衰老进程中非酒精性脂肪肝病自发产生的分子机制的研究进展

刘金艳，张彬，许赛君，赵晓宏，许扬，谢勇

100193 北京，中国医学科学院药用植物研究所中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是肝细胞从单纯性脂肪变性（SS）逐步发展到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌进程中一系列疾病的统称[1]。流行病学调查显示在全球范围内，NAFLD 的发病率约为 25%，且呈现日益增长趋势[2]，在男性中，NAFLD 的患病率倾向于从年轻到中年人群增加，并且与 NAFLD 的非老年患者相比，老年患者的 NASH 和晚期纤维化患病率更高[3]。美国器官共享网络联合会统计显示，2005 – 2017 年，NAFLD 发展为急慢性肝衰竭（ACLF）患者的候补注册人数从 134 名增加到 574 名，增长了 331.6%，随着NAFLD-ACLF 注册人数的持续增长和年龄增长，患者死亡的风险激增[4]。一项对日本 1829 名女性的调查显示，NAFLD 的患病率在该群体中随年龄增长而增加，且与体重增加或代谢综合征的影响无关，表明衰老是绝经前妇女 NAFLD 的危险因素[5]。随着年龄增加，NAFLD 发病率和恶化程度也随之增加，已被世界卫生组织（WHO）确认为危害身体健康的慢性病。迄今为止，NAFLD 的发病机制有“双重打击”和“多重打击”学说。双重打击学说针对肝脏病变机制，认为肝细胞内脂肪增加，突出表现为甘油三酯蓄积和胰岛素抵抗引起的肝脂肪变性为第一重打击；肝细胞内的炎症反应、线粒体功能障碍和氧化应激等增强诱导 NAFLD 发展为 NASH、肝纤维化以及肝硬化为第二重打击[6]。多重打击学说针对肝脏以外的诱导肝脏病变机制，认为遗传和环境因素的相互作用以及不同组织器官，诸如脂肪组织、胰腺、肠、肝脏等的代谢循环紊乱引发的广泛代谢失调诱发 NAFLD[7]。近年来的研究表明，伴随衰老导致的肝细胞代谢失调和炎症与 NAFLD 发生和恶化呈现正相关性。伴随细胞逐渐衰老，“双重打击”和“多重打击”随之增强是导致 NAFLD 发生和恶化的重要因素。动物细胞衰老主要表现为从正常分化二倍体细胞进入细胞周期停滞状态并丧失其增殖能力，导致细胞分裂能力下降[8]。在光学显微镜下可见衰老细胞的特征是细胞和细胞核明显变大。细胞的代谢失调被衰老进程中染色质病灶（SAHF）和分泌表型（SASP）增加等促进[9]。SASP 涉及促炎细胞因子、生长因子、蛋白酶、纤连蛋白、活性氧（ROS）和一氧化氮等的含量变化，细胞内这些物质含量显著增加表明细胞已经衰老。迄今为止，伴随衰老NAFLD 自发产生的分子机制尚不清楚。全面深入研究衰老进程中 NAFLD 自发产生的分子机制不仅补充 NAFLD 的发病机制认识的空白点，而且能为研发 NAFLD 新药提供新思路。

1 衰老进程中的 SAHF 诱发 NAFLD

1.1 端粒缩短诱发NAFLD

细胞衰老进程中 SAHF 增加的表型之一是端粒缩短。端粒位于染色体末端，为重复 DNA 序列和端粒结合蛋白组成的复合体，端粒长度变短证明细胞已经衰老[10]。端粒酶是端粒酶逆转录酶（hTERT）和端粒酶 RNA（hTERC）形成的复合体，具有核糖核酸蛋白酶功能，可催化真核生物端粒 DNA 的延伸[11]。正常肝脏中，伴随肝细胞衰老端粒酶活性也随之降低，导致端粒缩短。在年龄相仿情况下，NAFLD 患者的肝细胞端粒短于作为对照组的正常肝[12]，表明端粒缩短与脂肪变性存在紧密关联，同时也显示在同龄的人类中，细胞衰老进程加快的个体肝细胞内脂肪变性程度显著增加，可迅速发展为 NAFLD。动物实验表明，端粒酶功能障碍导致小鼠肝脏再生受损，并响应慢性肝损伤而加速了肝硬化的发展[13]，有学者认为端粒长度减少可作为判断肝组织硬化发生的一种标志[14]。在 NASH 发展为肝硬化的年轻患者来源的肝细胞内的端粒长度明显短于作为对照的正常人[15]，且细胞衰老标记物诸如 β-半乳糖苷酶、p16、p21 和 p53 等在肝细胞中表达量也显著高于正常人，SASP 为严重衰老型[16]。此外，端粒缩短也增加 NAFLD 介导的癌症易感性。从健康肝脏到 NAFLD-肝硬化-肝细胞癌（HCC）的发展进程中，外周血白细胞的端粒长度逐渐降低[17]。因此，衰老进程中端粒缩短导致 SAHF 增加，是 NAFLD 加速恶化推动力之一。

1.2 DNA 损伤诱发 NAFLD

细胞抵抗外部和内部环境变化产生的应激反应导致 DNA 损伤称为 DNA 损伤反应（DDR）。已经存在 DDR 的细胞通常激活 DNA 修复机制或通过抑制细胞周期来抵抗 DDR 对生命活动带来的不良影响。在抑制细胞周期的情况下，DDR 触发共济失调-毛细血管扩张突变（ATM）和提高 Rad3 相关的蛋白激酶表达量，提高 p53 磷酸化水平并激活 p21，导致细胞周期停滞[18]。同时，p21 和 p16抑制视网膜母细胞瘤因子（Rb）的磷酸化，使其与 E2F 转录因子结合并终止细胞周期的进程[19]，有利于肝细胞内变性脂肪蓄积。对比易发生 NAFLD 大鼠与 NAFLD 抵抗大鼠肝脏蛋白表达也观察到这样的 p21 和 p16 变化差异，但这种差异是由组蛋白的修饰差异引起的。与 NAFLD 抵抗大鼠相比，易发生 NAFLD 大鼠 p16 启动子和编码区组蛋白 H4 的乙酰化水平显著升高，p16 编码区中组蛋白 H3 赖氨酸 27 甲基化水平较低。在 p21 启动子上，组蛋白 H3 和 H4 的乙酰化水平均显著增加，p21 启动子组蛋白 H3 赖氨酸 27 三甲基化降低而二甲基化显著升高[20]。由此可见，衰老细胞内 DDR 和特定的组蛋白修饰差异具有正相关性，p21、p16 等蛋白的表达增加可作为判断 NAFLD 发生或恶化的标志[21]。

1.3 DNA 甲基化水平降低诱发 NAFLD

DNA 甲基化水平降低是衰老细胞SAHF 的另一种表型。比较缺乏胆碱和叶酸饲料喂养引起的 NAFLD 小鼠的 DNA 甲基化水平发现，肝脏 DNA 甲基化水平较低的小鼠更容易发生肝损伤[22]。而在人类肝脏活检中发现，相对于轻度 NAFLD，晚期 NAFLD 表现出明显的 DNA 低甲基化现象。在重度 NAFLD 中，纤维细胞生长因子受体 2（FGR2）和胱天蛋白酶 1（CASP1）甲基化水平显著降低，蛋氨酸腺苷甲基转移酶 1A（MAT1A）基因的甲基化水平升高[23]。肝脏内这些蛋白质基因的甲基化水平增加和 DNA 甲基化水平降低也可以作为判断 NAFLD 是否恶化的标志。

2 衰老进程中的 SASP 诱发 NAFLD

2.1 衰老基因表达诱发 NAFLD

衰老基因表达变化促进肝脏内脂肪变性。Zhang 等[20]通过研究高脂饮食（HFD）诱导的易肥胖和抗肥胖大鼠的衰老基因表达差异发现在基因转录水平上，易肥胖大鼠的 p16 和 p21 的 mRNA 水平显著升高；在蛋白水平上，NAFLD 大鼠肝脏中 p21 蛋白水平明显升高，激活 p16 的转录因子的 Ets1 蛋白质表达量也增加了 2.5 倍，但是 Rb 磷酸化水平却显著降低。衰老标记蛋白 30（SMP30）是一种抗凋亡蛋白，具有随着年龄的增加而减少的特点。动物实验显示，与单纯 db/db 小鼠相比，敲除 SMP30 的 db/db 小鼠的肝脂质和脂质过氧化水平升高，内质网应激增加，显示出伴有炎性反应和氧化应激的脂肪肝[24]。由此可见，SMP30 表达量减少和 p16、p21 等蛋白表达量增加有关，可能是筛选治疗 NAFLD 新药潜在的靶标。

2.2 衰老引起的线粒体失调诱发 NAFLD

线粒体生物合成减少是衰老的一项显著特征。细胞衰老可以通过诱导线粒体功能障碍，导致脂肪代谢活性低下，从而导致细胞脂肪变性。体外实验表明，与代谢年轻的肝细胞相比，代谢衰老肝细胞的线粒体分解棕榈酸诱导蓄积在细胞内脂质的能力降低[25]。因此衰老细胞中变性脂肪容易积累。在动物实验中，与幼年和青年鼠相比，中年小鼠更容易产生饮食诱导的胰岛素抵抗，发展为 NAFLD 的敏感性更高，同时细胞内线粒体质量减少，肝脏中柠檬酸合酶活性降低，可能与核因子类红细胞衍生因子 2 样蛋白 2（NFE2L2）介导的肝线粒体的脂肪酸氧化能力降低有关[26]，意味着衰老动物体内的三羧酸循环活性低下。人类肝脏活检发现，与轻度脂肪变性相比，NASH 患者肝脏中线粒体编码的 NADH 脱氢酶 6（MT-ND6）高度甲基化，DNA 甲基转移酶水平也升高，线粒体出现形态缺陷和过氧化物酶体增殖等[27]是促进变性脂肪蓄积的原因。

3 嘌呤核苷酸恶化衰老动物体内NAFLD 症状

近期我们发现肌苷酸（IMP）、腺苷酸基琥珀酸（S-AMP）、腺苷酸（AMP）等嘌呤核苷酸都能和人体内AMP 活化蛋白激酶（AMPK）的γ 亚基形成复合体，提高AMPK α 亚基上Thr172 的磷酸化水平而活化AMPK[28-29]。应用油酸诱导的脂质蓄积的 HepG2 细胞的降脂实验显示，AMPK 被 IMP 等嘌呤核苷酸活化后显示出比洛伐他汀更强的降脂活性，细胞内甘油三酯脂肪酶（ATGL）和乙酰辅酶 A 羧化酶 2（ACC2）的表达量和磷酸化显著上升，表明细胞内的脂肪分解为脂肪酸以及脂肪酸被氧化代谢的活性被显著增加[28-29]。对饮食诱导产生 NAFLD 的 3 月龄小鼠以剂量 300 mg/kg 的 S-AMP 灌胃给药 18 d 后能导致小鼠的血脂浓度和肝细胞内脂质蓄积降低[28]，而对 6 月龄 db/db 小鼠以剂量 50 mg/kg 的 IMP 灌胃给药 8 周后发现小鼠肝细胞内蓄积增加，血清中总胆固醇（TC）含量比未给药 db/db 小鼠增加约 3 倍，磷酸化的乙酰辅酶 A 羧化酶 2（ACC2）的表达量显著上升，肝脏内乙酰辅酶 A 含量也显著增加，不同于体外实验结果，肝细胞内ATGL 表达量未见显著变化，NAFLD 症状反而恶化[29]，造成上述差别的原因是嘌呤核苷酸激活 AMPK 后促进肝细胞体内脂肪酸加速氧化，乙酰辅酶 A 是脂肪酸 β 氧化的重要中间产物，是体内合成 TC、TG 和经由三羧酸循环（TCA）分解为 CO2和 H2O 的原料。伴随身体衰老 TCA 循环活性随之降低[30]，当 TCA 循环不能消耗因脂肪酸过度氧化产生的乙酰辅酶 A 时，乙酰辅酶 A 蓄积在肝脏内主要被用于合成 TC 和 TG。TC 进入到小肠内促进脂肪消化为脂肪酸，脂肪酸被吸收后直接进入肝脏后加大肝细胞内脂肪酸氧化水平，于是形成了嘌呤核苷酸驱动的胆固醇介导的肝脏内利用外源脂肪酸合成新甘油三酯的通路。肝脏组织形态学分析表明，正常饲料饲养的 8 月龄小鼠已经存在明显的 NAFLD 症状，而 4 月龄小鼠尚未有明显的肝脏细胞内脂质蓄积[28-29]。因此，这个通路的活性随衰老导致的 TCA 循环活性降低而更加活跃，是肝脏受到第一重打击的重要推动力。此外，由于脂肪酸加速氧化，肝脏内需要产生更多的活性氧来完成相应的脂肪酸氧化，因此形成了肝脏氧化应激，使得SAHF 和 SASP显著提高，这是肝脏受到第二重打击的重要推动力。结合已有的自然衰老小鼠体内发生 NAFLD 的作用机制，嘌呤核苷酸促进 NAFLD 发生和分子机制如图 1 所示。

图 1 衰老小鼠的肝细胞内 IMP 等嘌呤核苷酸启动双重打击诱发 NAFLD 的分子机制（衰老小鼠体内活性低下的 TCA 通路用细线表示，此时，嘌呤核苷酸活化 AMPK 促进脂肪酸氧化产生的乙酰辅酶 A 主要被用于合成 TC 和 TG，TC 促进肠道中脂肪的消化和生成的脂肪酸被吸收进入肝脏，加大了对肝脏的二重打击）

4 总结与展望

高脂、高糖等特殊饲料诱导产生 NAFLD 的小鼠或大鼠以及敲除瘦素受体或瘦素基因的小鼠等是常用于研究 NAFLD 的发病机制和药物研究的模型动物[31]，从中发现了用于筛选治疗 NAFLD 药物的靶蛋白。在新药研发方面国内外都取得了重大进展，一些候选药物已进入到 III 期临床试验，但迄今为止依然没有新药获批上市[32-33]。中华医学会肝病分会药物性肝病学组组长茅益民教授认为迄今为止还没有任何动物模型能够完全模拟 NASH 等的病理特征、发病机制等是造成这一困境的重要原因（上海国际肝病高峰论坛，上海，2020.12.11 – 13）。鉴于人、小鼠等动物在自然衰老进程中会自发产生 NAFLD，正常饲养小鼠产生 NAFLD 的年龄段是小鼠从发育成熟期到中年衰老期间[28-29]，这个正好和人体自发产生 NAFLD 的年龄段高度吻合，因此 4 ～8 月龄小鼠的 NAFLD 发病机制能更准确地模拟人体内对应病症的病理特征、发病机制，应该作为研究 NAFLD 发病机制的新模型，深入开展不同衰老时间点的代谢失调机制研究。

自然衰老小鼠体内发生 NAFLD 以及外源性嘌呤核苷酸促进衰老 db/db 小鼠的 NAFLD 发展的分子机制提示我们，衰老进程中动物体内嘌呤核苷酸代谢障碍可能随之加重，一旦肝脏内形成嘌呤核苷酸蓄积就促进 NAFLD 发生和恶化。今后的研究应该聚焦于衰老导致嘌呤核苷酸代谢障碍的变化规律及其诱导NAFLD 产生的作用机制。如果证明衰老导致身体内嘌呤核苷酸蓄积，降低嘌呤核苷酸蓄积应该作为研发 NAFLD 药物的新思路。因为降低了衰老动物体内的嘌呤核苷酸含量，脂肪酸过度氧化引起肝细胞内乙酰辅酶 A 蓄积将被抑制，由此引起的TG 过度合成、胆固醇过度合成等都可能随之降低，同时线粒体功能紊乱和 DDR 等都可能随之降低，二重打击造成肝损伤将缺乏推动力，最终改善 NAFLD 症状。

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谢勇，Email：yxie@implad.ac.cn

2021-01-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.008