蛹虫草固态发酵联产多糖和纤溶酶的工艺优化

王明瑞,邓永平,2,*,宋青燕,陈悦彬,刘晓兰,2

(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江齐齐哈尔 161006; 2.黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室,黑龙江齐齐哈尔 161006)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)为药食同源大型真菌,在中华人民共和国卫生部2009年第3号公告中被正式批准为新资源食品,在卫生计生委2014年第10号公告中被纳入新食品原料。蛹虫草中含有多种生物活性成分[1-2],其中多糖是蛹虫草子实体、菌丝体或发酵液中含量最丰富的活性成分,具有抗高血脂[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、免疫调节[6]等功效,已成为蛹虫草功能食品开发和质量控制的指标之一[2]。研究表明,蛹虫草发酵菌丝体多糖含量较人工栽培子实体多糖含量高约10%(m/m),在同等浓度下对肿瘤细胞的抑制率高约20%[7-8],因此,利用发酵法生产蛹虫草多糖更加经济有效。

血栓栓塞性疾病严重危害人类的生命和健康。纤溶酶能够将构成血栓的纤维蛋白凝块降解为小分子代谢物,具有溶解血栓或者降低血栓倾向的功能[9]。因此,含有纤溶酶的保健食品或药品的研发一直是热点。从药食同源大型真菌中提取纤溶酶作为功能性食品添加剂或药物用于预防和治疗血栓性疾病已展现出巨大的潜力[9]。目前,已经报道了多种来自大型真菌的纤溶酶,例如:冬虫夏草(Cordycepssinensis)[10]、金针菇(Flammulinavelutipes)[11]、杏鲍菇(Pleurotuseryngii)[12]、裂褶菌(Schizophyllumcommune)[13]、本占地菇(Lyophyllumshimeji)[14]、平菇(Pleurotusostreatus)[15]、蛹虫草(Cordycepsmilitaris)[16]等。

基于蛹虫草珍贵的食药用价值,开发蛹虫草或其代谢产物的研究工作一直在进行。陈慧鑫等[17]通过对葡萄糖和豆粕发酵工艺的优化同时获得了蛹虫草菌丝体和纤溶酶。Wang等[18]确定重复分批培养方法生产蛹虫草胞外多糖的碳氮源分别是葡萄糖和酵母提取物。Yang等发现以蔗糖和酵母提取物为底物时蛹虫草CGMCC 2909可联产菌丝体、多糖、腺苷和甘露醇[5]。Dang等[19]研究了生长因子和谷物对蛹虫草菌丝体生长和代谢产物的抗氧化活性影响,确定在葡萄糖培养基中加入糙米、白米、小麦等谷物有助于蛹虫草菌丝体的生长和产物合成。Xiao等[20-23]研究了蛹虫草发酵对鹰嘴豆、绿豆、红豆、燕麦的抗氧化性能的影响,确定通过发酵提高了产物的抗氧化能力,为蛹虫草功能食品的生产奠定了基础。

玉米位列五谷之首,被称为“黄金作物”。但是由于玉米粉中缺乏面筋蛋白,所以限制了其主食化应用[24]。研究表明,经过微生物发酵后的玉米粉热稳定性和抗回生性均有所提高,在食品加工上更具有开发潜力[25]。另外,有报道证明玉米粉为基质能有效提高大型真菌多糖含量[26]。本论文以玉米粉为主料,以胞外多糖含量和纤溶酶的活力为指标,研究了蛹虫草固态发酵联产胞外多糖和纤溶酶的工艺条件。与已有同类研究相比,本文的研究既有利于提高玉米资源的生物利用度,又能同时获得两种高附加值的产物。通过本文的研究有望为开发含蛹虫草天然功能因子的食品原料提供技术参考,为玉米深加工提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛹虫草菌(Cordycepsmilitaris) 分离自大兴安岭林区,现保存于黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室;马铃薯、玉米粉、麸皮 购自齐齐哈尔市浏园市场;牛血纤维蛋白原、牛凝血酶(500 U/mL) 购自中国医学科学院天津血研所;MgSO4、KH2PO4、蛋白胨、葡萄糖、苯酚 分析纯,购自天津市凯通化学试剂有限公司。

himac CF15RX冷冻离心机 天美科学仪器有限公司;SPX-150BS-Ⅱ生化培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养方法 斜面培养基及培养方法:斜面培养基由葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、马铃薯200 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、琼脂20 g/L组成。将蛹虫草菌株划线接种至斜面上,在23 ℃培养7 d。平板培养基及培养方法:培养基组成同斜面培养基。挑取斜面培养物划线接种至平板表面,在23 ℃培养15 d。种子培养基及培养方法:种子培养基由葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、马铃薯200 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L组成,250 mL三角瓶装入100 mL液体种子培养基。用无菌打孔器在平板培养物上取出直径1.5 cm的菌块,接种到种子培养基中,23 ℃、180 r/min振荡培养5 d。

1.2.2 营养物比例的选择 培养容器为250 mL三角瓶,培养基干基重20 g,其中玉米粉和麸皮的质量比分别为20∶0、19∶1、18∶2、17∶3、16∶4 (g/g),加水量为10 mL,加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),接种10%(V/m)种子培养液,23 ℃培养3 d,检测胞外多糖含量和纤溶酶活力。

1.2.3 培养基料水比例的确定 250 mL三角瓶中加入18 g玉米粉和2 g麸皮,干物质与水的质量体积比分别为2∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2 (m/V),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),接种10%(V/m)种子培养液,23 ℃培养3 d,检测胞外多糖含量和纤溶酶活力。

1.2.4 接种量的确定 250 mL三角瓶中加入18 g玉米粉和2 g麸皮,料水比例为1∶1 (m/V),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),分别接种1%、3%、5%、7%、10%、15%、20%(V/m)种子培养液(种子培养液的加入体积计入培养基添加总水分含量中),23 ℃培养3 d,检测胞外多糖含量和纤溶酶活力。

1.2.5 培养时间的确定 250 mL三角瓶中加入18 g玉米粉和2 g麸皮,料水比例为1∶1 (m/V),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),接种7%(V/m)种子培养液,23 ℃分别培养2、3、4、5 d,检测胞外多糖含量和纤溶酶活力。

1.2.6 培养温度的确定 250 mL三角瓶中加入18 g玉米粉和2 g麸皮,料水比例为1∶1 (m/V),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),接种7%(V/m)种子培养液,分别在21、23、25 ℃分别培养3 d,检测胞外多糖含量和纤溶酶活力。

1.2.7 正交试验优化培养条件 在单因素实验基础上利用L9(34)正交试验设计进一步优化培养条件,优化因素分别为接种量(A)、培养时间(B)和培养温度(C),选取三个水平进行试验(见表1)。

1.2.8 发酵产物的处理 向固态发酵物中加入100 mL蒸馏水,在23 ℃、150 r/min条件下浸提4 h,4 ℃、6000 r/min离心10 min,收集上清液,置4 ℃冰箱中保存。

1.2.9 纤溶酶活力的测定 采用血纤维蛋白平板法测定蛹虫草纤溶酶活力,平板制备方法和酶活力测定方法见文献[17]。取10 μL上清液点加于血纤维蛋白平板表面,37 ℃保温6 h后测定溶圈面积。血纤维蛋白是构成血栓的主要成分,纤溶酶活力与其在血纤维蛋白平板上形成的溶圈面积呈正相关。由于不同批次市售尿激酶标定活力单位存在差异,致使标准曲线不统一,因此本文以纤溶酶在血纤维蛋白平板上形成的溶圈面积表示酶活力。

1.2.10 胞外多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测胞外多糖含量[18]。标准曲线方程为:y=0.14394x+0.0028,其中y为多糖含量,单位为mg/mL,x为490 nm处的吸光值,R2=0.9923。

1.3 数据处理

利用Excel 2003和SPSS 11.5分析软件对数据进行统计分析,所有实验均重复三次,采用Duncan氏法进行多重比较,图中同系列柱状图或折线图上标不同小写或大写字母表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 玉米粉与麸皮比例的选择

在固态发酵过程中,培养基中较大的孔隙度能更好的满足氧气流通,促进菌丝生长[27]。蛹虫草菌丝体对氧气需求较高,因此选择麸皮作为固态培养基的疏松剂,同时麸皮含有淀粉和纤维,还能起到碳源的作用。研究了玉米粉与麸皮的比例对胞外多糖含量和纤溶酶的活力的影响,结果见图1。

图1 玉米粉与麸皮比例对多糖含量和纤溶酶活力的影响Fig.1 Effect of the ratio of corn flour and wheat bran on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity注:图中不同小写字母表示胞外多糖含量的 差异显著(P<0.05),不同大写字母表示 纤溶酶活力的差异显著(P<0.05),图2～5同。

如图1所示,适当提高培养基中麸皮的含量有助于提高多糖含量和纤溶酶活力,当玉米粉与麸皮比例为18 g∶2 g时胞外多糖含量和纤溶酶活力均显著高于其他营养物比例(P<0.05)。当培养基中不添加麸皮或添加量为1 g时,培养基疏松性较差,不利于氧气流通,菌体生长能力下降,导致多糖含量和纤溶酶活力降低;当培养基中麸皮含量大于2 g,玉米粉含量相应减少时,菌体生长速度减慢,导致产物合成能力下降。因此,确定营养物比例为18 g∶2 g。

2.2 培养基料水比例的确定

培养基料水比例对于营养物质的溶解状态,以及培养基的孔隙率和生物结构的稳定性均会有较大的影响,进而对菌体生长和活性物质的积累产生一定的影响[28]。培养基料水比例对蛹虫草胞外多糖含量和纤溶酶的活力的影响结果见图2。

图2 料水比例对多糖含量和纤溶酶活力的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity

由图2可知,培养基料水比例为1∶1 (m/V)时蛹虫草胞外多糖含量和纤溶酶活性显著高于其他料水比(P<0.05)。在固态发酵培养基中微生物可利用的水含量与培养基溶质浓度、毛细作用力和吸收特性有关[28]。当料水比为2∶1 (m/V)时,微生物可利用的水分极少,不利于营养物质胞外降解和吸收,导致菌体生长和代谢产物合成受到抑制。真菌菌丝延伸以及孢子萌发和产物合成对水分胁迫很敏感[28],当料水比为1∶1.5、1∶2 (m/V)时,培养基粘稠度提高,不利于氧气流通,水分对菌体生长和产物合成的胁迫导致多糖含量和纤溶酶活力降低。不同的料水比对大型真菌发酵产生物活性物质具有不同的影响,例如蛹虫草发酵五味子药渣时料水比1∶2有利于虫草素含量的提高[29];羊肚菌发酵豆渣产胞外多糖最适料水比是1∶9[30]。在本文中,蛹虫草发酵产胞外多糖和纤溶酶的最适料水比例为1∶1(m/V)。

2.3 接种量的确定

接种量是影响发酵效率的主要因素,接种量过小会导致菌丝体生物量低,而接种量过大会产生不必要的养分消耗,导致真菌细胞养分匮乏并在发酵阶段停止生长[31]。接种量对胞外多糖含量和纤溶酶的活力的影响结果见图3。

图3 接种量对多糖含量和纤溶酶活力的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity

如图3所示,当接种量为5%(V/m)时胞外多糖含量最高,但是与接种量3%(V/m)和7%(V/m)时没有显著性差异(P>0.05)。从以往一些报道来看,虫草属真菌产胞外多糖的接种量一般都比较低,如CordycepssinensisUM01产胞外多糖的最适接种量为3%(V/m)[32],CordycepsmilitarisSU5-08产胞外多糖的最适接种量为4%(V/m)[5]。从纤溶酶活力判断,当接种量为7%(V/m)时蛹虫草纤溶酶活力显著高于其他接种量时酶活力(P<0.05)。因此,综合考虑两种产物确定接种量为7%。

2.4 培养时间的确定

随着培养时间的进行,菌体生长并产生代谢产物,引起培养环境的变化,进而影响目标产物产量。培养时间对蛹虫草多糖和纤溶酶的影响见图4。

图4 培养时间对多糖含量和纤溶酶活力的影响Fig.4 Effect of cultivation time on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity

如图4所示,在培养蛹虫草至2、3、4 d时胞外多糖含量没有显著性差异(P>0.05),但是均显著高于第5 d的含量(P<0.05);纤溶酶活力在培养至第3 d时显著高于其他培养时间(P<0.05)。这是因为随着培养时间延长,营养成分逐渐消耗,导致产物合成速率下降,胞外酶的活性逐渐降低[28]。因此,确定培养时间为3 d。

2.5 培养温度的确定

培养温度是影响真菌生长和代谢的主要因素之一,低温培养会减缓菌丝代谢速率,延长生产周期,高温培养易导致菌丝快速老化,抑制产物生成[33]。在前期研究中发现,本文中蛹虫草菌适宜在21～25 ℃条件下生长,温度超过25 ℃会使菌种生长缓慢[17,34]。因此研究了21、23、25 ℃的培养温度对蛹虫草多糖和纤溶酶的影响,结果见图5。

图5 培养温度对多糖含量和纤溶酶活力的影响Fig.5 Effect of cultivation temperature on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity

如图5所示,实验范围内的培养温度对蛹虫草胞外多糖含量没有显著影响(P>0.05);但是,培养温度对纤溶酶活力有显著影响,当培养温度为23 ℃时纤溶酶活力显著高于21和25 ℃(P<0.05)。这可能是因为胞外酶的活性对培养温度更为敏感[33],蛹虫草产α-半乳糖苷酶和几丁质酶的最适温度也是23 ℃[35-36]。

2.6 正交试验

接种量、培养时间和培养温度是影响固态发酵效率的主要因子[33]。根据单因素实验结果,采用L9(34)正交试验对蛹虫草固态发酵玉米粉联产胞外多糖和纤溶酶的培养条件进一步优化,结果见表2、表3和表4。

由表2可知,根据多糖均值判断最优化组合为A2B2C2,即接种量为6%(V/m)、培养时间3 d、培养温度23 ℃。根据极差判断影响多糖含量的主次因素顺序依次为A>B>C,即接种量>培养时间>培养温度。根据纤溶酶溶圈面积均值判断最优化组合为A2B2C2,即接种量为6%、培养时间3 d、培养温度23 ℃。根据极差判断影响纤溶酶活力的主次因素顺序依次为A>C>B,即接种量>培养温度>培养时间。

方差分析结果如表3和表4所示,实验选择的各因素对于胞外多糖含量没有显著性影响(P>0.05),但是接种量对纤溶酶活力有显著性影响(P<0.05)。

经过发酵实验验证该工艺条件较稳定。最终确定蛹虫草固态发酵玉米粉联产胞外多糖和纤溶酶的条件为:250 mL三角瓶中装有20 g培养基,培养基由玉米粉和麸皮组成,比例为18∶2,加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),料水比例为1∶1,接种量为6%(V/m),在23 ℃培养3 d,经100 mL蒸馏水浸提后得到的浸提液中胞外多糖含量为3.23 mg/mL,纤溶酶在血纤维蛋白平板形成的溶圈面积为169.34 mm2。

3 结论

表2 L 9(34)试验结果Table 2 The result of L 9(34)orthogonal experiment

表3 方差分析结果(多糖)Table 3 The result of analysis of variance(polysaccharides)

表4 方差分析结果(纤溶酶)Table 4 The result of analysis of variance(fibrinolytic enzyme)

蛹虫草胞外多糖和纤溶酶具有多种生理功效,为了更好开发蛹虫草功能食品基料,本文以玉米粉为主料,对蛹虫草菌固态发酵联产胞外多糖和纤溶酶的工艺进行了研究。经过单因素和正交试验确定了250 mL三角瓶中蛹虫草固态发酵玉米粉联产胞外多糖和纤溶酶的培养基构成为玉米粉和麸皮,比例为18∶2 (g/g),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),料水比例为1∶1 (m/V),接种量为6%(V/m),在23 ℃培养3 d,经100 mL蒸馏水浸提后得到的浸提液中胞外多糖含量为3.23 mg/mL,纤溶酶在血纤维蛋白平板形成的溶圈面积为169.34 mm2。以玉米粉为主料培养蛹虫草联产多糖和纤溶酶两种功能因子,既有助于改善玉米粉的营养状态,又赋予了培养物新的生理活性。将发酵后的玉米粉作为原料开发功能食品,将具有广泛的应用前景。