DHA藻油毒理学研究进展

兰 韬,汪志明,赵 琳,陆姝欢,舒 敏,李翔宇,*

(1.中国标准化研究院农业食品标准化研究所,北京 100191; 2.嘉必优生物工程(武汉)有限公司,湖北武汉 430073)

二十二碳六烯酸藻油(Docosahexaenoic acid algal oil,DHA藻油)是采用裂壶藻(Schizochytriumsp.)或者吾肯氏壶藻(Ulkeniaamoeboida)或者寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)等藻种为原料[1-2],经生物发酵、提取、冬化、精制、脱色、除臭等过程制得富含DHA的油脂[3-4]。

DHA藻油中所含的DHA是一种对人体非常重要的ω-3不饱和脂肪酸[5]。它是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分,是大脑和视网膜的重要组成成分,对胎婴儿智力和视力发育至关重要[6-7],同时还有降低心脑血管疾病风险[8-10],缓解抑郁症的功效[11]。DHA可以由α-亚麻酸合成,也可以直接从母乳、鱼油或藻油中获得[12]。其中DHA藻油具有DHA含量高、无重金属污染、EPA含量较低、安全易吸收等优点而被广泛应用[13]。

DHA藻油除了富含DHA外,还含有4%～5.6%的二十二碳五烯酸(DPA)以及19种饱和脂肪酸酯和24种不饱和脂肪酸酯等[14],还有一些不可皂化的角鲨烯、甾醇和类胡萝卜素。其中DPA(ω-6)是人体饮食中的正常组成成分,牛肉、鸡肉、蛋、猪肉以及大量海产品中都含有DPA。DHA所含的其他脂肪酸组分也较为安全,角鲨烯、甾醇和类胡萝卜素等也都是常见的食品添加剂。所以可以认为DHA藻油中各主要成分基本都是安全的[15]。

目前DHA藻油已被广泛应用于配方乳粉、保健食品等产品中,但其加工过程涉及藻类自然发酵过程,这一过程产生了DHA、DPA等重要营养物质,也增加了一定的安全风险。因此对DHA藻油的毒理学评价十分必要。而且目前还没有对DHA藻油安全使用上限进行完整研究的报道。为确保其安全使用,本文将对DHA藻油的主要成分、临床前动物毒理学研究、临床毒理学研究进行介绍,确定DHA藻油的安全使用上限,以及作为食品原料需要注意的关键控制点,为监管部门、相应生产企业制定和推荐DHA藻油的日使用量提供了数据依据。

1 DHA藻油的毒理学研究

1.1 临床前动物毒理学研究

DHA藻油临床前动物毒理学实验研究以裂壶藻、吾肯氏壶藻、寇氏隐甲藻为研究对象,主要实验动物以大鼠为主,具体包括急性毒理学实验、亚急性毒理学实验、亚慢性毒理学实验、慢性毒理学实验等。研究中大多以生长情况、血液指标、临床化学参数、大体病理学和组织病理学等作为考核指标,评估实验动物食用DHA藻油后的安全性。下面按急性毒理学实验、亚急性毒理学实验、短期毒理学实验、亚慢性毒理学实验、生殖毒理学实验、遗传毒理学实验等方面分别进行论述。

1.1.1 急性和亚急性毒理学研究 急性毒理学实验是对化合物毒理学安全性评价的首要工作,可以了解机体一次或24 h内多次接触该外源化合物后,在短期内(一般4～14 d)引起的中毒效应,在不同类型化学物的法规制定程序中是必做实验[16]。急性毒理学实验主要测定半数致死量(LD50),确定化合物的中毒方式、中毒反应,并为亚急性和慢性中毒实验的观察指标及剂量分组提供参考。亚急性毒性实验是指机体在24 h～28 d内多次或连续暴露于外源化合物后出现的不良反应。检验受试验物质(添加剂)的毒性对机体的重要器官或生理功能的影响,并估量发生影响的剂量,为慢性毒性试验做准备[17]。

目前有较多DHA藻油原料都申请了美国FDA(Food and Drug Administration)的GRAS(Generally Recognized as Safe)食品,同时DHA藻油原料在申请我国国内新食品原料过程中,急性毒理学实验数据都是必须提供的。鉴于此,DHA藻油的急性和亚急性毒理学实验研究也较多,DHA藻油的急性和亚急性毒理学实验设计和结论见表1。从表1可以看出,用寇氏隐甲藻和裂壶藻来源的DHA藻油在最高20000 mg/kg/bw的剂量下饲喂大鼠和猪14 d后,动物的生长、发育、血常规、尿常规、解剖后均未发现异常,说明对于大鼠和猪，其LD50大于20000 mg/kg/bw,寇氏隐甲藻和裂壶藻两种来源的DHA藻油没有表现出急性和亚急性毒性,这两种来源的DHA藻油属于实际无毒级别。

1.1.2 亚慢性和慢性毒理学研究 亚慢性毒理学实验是机体在连续较长时间(相当于1/10生命周期,对于大鼠一般是90 d)接触不同较大剂量(低于LD50)外源化合物后所产生的毒理学效应。慢性毒理学实验是确定外来化合物的毒理学下限,即长期接触该化合物可以引起机体危害的阈剂量和无作用剂量,对于大鼠一般是120 d。为进行该化合物的危险性评价与制定人接触该化合物的安全限量标准提供毒理学依据,如最高容许浓度和每日容许摄入量等[24]。本文对DHA藻油动物亚慢性和慢性毒性实验设计和结论进行了综述,列于表2中,从表2中可以看出，寇氏隐甲藻、裂壶藻、吾肯氏壶藻三种藻种来源的DHA藻油在2000～4260 mg/kg/bw的喂食剂量下,饲喂大鼠90～120 d,大鼠没有出现死亡,体重,食物消耗,行为,血液学,临床化学,凝血或尿分析等参数未见异常,说明三种常见来源的DHA藻油的大鼠LD50大于4260 mg/kg/bw,三种常见来源的DHA藻油没有表现出亚慢性和慢性毒性。

1.1.3 生殖、发育和遗传毒理学研究 生殖、发育和遗传毒性也是食品原料安全性的重要指标。多项研究证明DHA藻油没有表现出生殖毒理学和发育毒理学。补充DHA藻油的样品组和对照组相比,体现生殖能力的发情周期持续时间、生育率、妊娠长度和每胎幼崽数等参数没有明显差异。雌性动物接触DHA藻油后,新生子代从出生到断奶期间均未发现统计学上显著的剂量依赖不良反应。大鼠或兔的子代器官发育、着床后胎儿死亡概率、平均胎儿体重或胎儿畸形情况没有较大差异。一些研究采用体外或体内研究方法评估了DHA藻油的遗传毒理学,所有致突变性和基因毒理学实验结果均为阴性,可认为DHA藻油无遗传毒理学。

表1 DHA藻油动物急性和亚急性毒理学实验研究结果Table 1 Results of the acute and subacute animal oral toxicity tests of DHA algal oil

表2 DHA藻油动物亚慢性和慢性毒性实验研究结果Table 2 Results of the sub-chronic and chronic animal oral toxicity tests of DHA algal oil

DHA藻油对于动物的生殖、发育和遗传毒性研究结果表述见表3。从表3中可以看出,裂壶藻、寇氏隐甲藻、吾肯氏壶藻三种藻种来源的DHA藻油以最高20700 mg/kg/bw的喂食剂量饲喂大鼠,大鼠的发情周期,交配性能,生育力,妊娠期,分娩和妊娠指数、产仔数、后代体重、F1代的生理发育等生殖参数均没有表现出异常,说明DHA藻油的无害作用剂量(NOAEL)可达20700 mg/kg/bw,可认为其没有生殖毒性和发育毒性。

对几种大鼠细胞进行了DHA藻油的给药实验,发现DHA藻油在给药剂量为1000～5000 mg/kg时,没有表现出致突变作用、骨髓毒性和遗传毒性。

表3 DHA藻油动物生殖、发育和遗传毒理学研究结果Table 3 Results of the reproductive,developmental and genetic animal oral toxicity tests of DHA algal oil

表4 DHA藻油临床毒理学研究结果Table 4 Results of clinical toxicology of DHA algal oil

1.2 临床毒理学研究

本文对裂壶藻来源的DHA藻油的临床毒理学进行了汇总列于表4中。多项临床实验研究证明,DHA藻油在最高6000 mg/d的给药剂量下,对人体无不良反应,添加DHA藻油后的婴儿配方乳粉不会显著影响婴儿的生长。成人摄取DHA藻油后[34-40],摄入DHA不会对血小板功能或凝血产生不利影响,不会增加脂质过氧化,低剂量的DHA对免疫功能无影响,而基于DHA介导的某些免疫细胞功能在DHA摄入水平升高时受到抑制,当DHA摄入水平升高时,个体感染的风险可能更高。对于高血压糖尿病患者,摄取剂量超过4000 mg/d的DHA后,对短期血糖控制有不良影响。

在最近的一项为期120 d的临床研究中[41],足月儿在14～120 d的时间内被喂养含DHA配方乳粉(17 mg DHA/100 kcal)以评估对生长和耐受性的影响。在120 d的年龄段内,各性别的生长率没有显著差异。这项研究表明了DHA藻油对婴儿的临床安全性和耐受性。

综上所述,DHA藻油对动物体和人体在较高的剂量范围都是安全的。

2 DHA藻油产品质量关键控制点

目前对于DHA藻油的动物实验和临床实验均建立在产品质量合格的DHA藻油原料基础上,但DHA藻油的产品质量也存在一些关键控制点,包括重金属和储存条件等,若相应的关键控制点出现问题,也将影响DHA藻油产品质量,甚至产生毒副作用。

2.1 重金属

DHA藻油主要采用培养海藻生产不饱和脂肪酸的微生物培养法。对于藻油来源的DHA,主要是在密闭的发酵罐中进行DHA的生产和富集,原料来源可控,本团队采集了10种市售的DHA藻油样品,并进行了铅、砷、汞等重金属含量的检测,结果显示这些藻油中均未检出常见的重金属,说明DHA藻油在重金属方面没有明显安全隐患,应更加关注加工过程中其他外源性风险指标的控制[42-43]。

2.2 储存条件

DHA属于ω-3多不饱和脂肪酸,极易被氧化变质,氧化后的ω-3多不饱和脂肪酸食品会形成过不饱和脂肪酸食品,从而失去其商业和营养价值[44-45]。若长期过多摄入多不饱和脂肪酸油脂,会引起体内脂质过氧化反应上升和抗氧化酶活性降低[46-48],引发炎症、动脉粥样硬化、癌变[49-51]等。由于DHA藻油中含有丰富的胡萝卜素类物质,所以DHA藻油具有很好的抗氧化效果,但在正常的生产和储运过程中,依然需要注意增加适量的抗氧化剂(如维生素E、抗坏血酸棕榈酸酯等)[52-53],以保证原料的功能性和安全性。

3 总结

本文对DHA藻油的急性、亚急性、亚慢性、慢性、生殖、临床毒理学文献进行了梳理,发现裂壶藻、吾肯氏壶藻、寇氏隐甲藻三种藻源发酵来源的DHA藻油在最高20700 mg/kg/bw剂量范围内均未表现出相应的毒性,DHA藻油在最高6000 mg/d的给药剂量下,对人体无不良反应,婴儿摄取添加DHA藻油后的婴儿配方乳粉不会显著影响婴儿的生长。DHA藻油作为食品原料，应重点关注加工过程中其他外源性风险指标的控制,同时在储运贮藏过程中,应注意增加适量的抗氧化剂(抗坏血酸棕榈酸酯和维生素E)以保证原料的功能性和安全性。本文梳理的结果对于监管部门、相应生产企业制定和推荐DHA藻油的日使用量提供了数据依据。