气相色谱法测定柑橘类果皮挥发油柠檬烯含量的方法研究

邵建群 李青原 李风华 石 晨 王玉记 张 枫

(首都医科大学药学院实验教学中心，北京 100069)

柠檬烯(limonene)属于单萜类化合物，学名为1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环已烯，为无色或淡黄色的油状液体。柠檬烯大量存在于柑橘类植物的果皮中，主要以D-柠檬烯形式存在，是一种天然的活性单萜[1-2]。柠檬烯不仅广泛应用于香精香料领域，由于柠檬烯具有多种生物活性和药理作用，可以作为止痛祛痰、消炎镇咳的药物加以应用[3]。研究[4-6]表明，柠檬烯对很多细菌和真菌都具有较强的抗菌活性；具有较强的抗氧化作用[7-8]，是一种天然的抗氧化剂，可用于食品的保鲜[9-10]。国内外的研究[11-14]还显示，柠檬烯可以抗肿瘤，具有抑制细胞周期与诱导细胞凋亡及抑制肿瘤细胞的增殖与转移的作用。柠檬烯广泛存在于天然植物中，鉴于柠檬烯的多种食用和药用价值，合理的开发可最大程度地利用这些天然资源。而柠檬烯含量的多少是一个重要检测指标，柠檬烯的测定方法也有一些文献[15-16]报道。本文采用水蒸气蒸馏法先从柑橘的果皮中提取得到挥发油，然后对挥发油中柠檬烯的含量进行气相色谱的定量分析。按本文所建立的方法，笔者对市场上销售的多种柑橘果皮提取到的挥发油进行了柠檬烯含量的测定。

柑橘果皮是柑橘类产品的副产物，大量丢弃也会引起环境污染，而要变废为宝从柑橘果皮中提取其挥发油，柠檬烯就是一个主要监测指标。本文所建立的气相色谱测定方法，就是为天然柠檬烯原料的进一步开发利用提供质量评价方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

气相色谱仪(7890B，美国Agilent公司)；自动进样器(G4513A，美国Agilent公司)；色谱柱 HP-5(J&W GC Columns,30 m×0.32 mm×0.25 μm，美国Agilent公司)；BT25S电子分析天平，TE412-L型电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；RCTBS025控温磁力搅拌器(德国IKA公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；电子调温电热套(天津泰斯特仪器有限公司 98-1-B型)；LABOROTA 4000-efficient型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)。

1.2 试剂

标准对照品D-柠檬烯(中国食品药品检定研究院)；丙酮、石油醚(60～90 ℃)、无水硫酸钠、氯化铵、氯化钠(均为分析纯，北京化工厂)；实验所用陈皮购于百姓阳光大药房，其他柑橘类果皮均购于北京市售的果品。

1.3 溶液配制

1.3.1 柠檬烯对照品系列标准溶液的制备

精密称取柠檬烯176 mg于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解定容，浓度为17.6 mg/mL。准确吸取此溶液0、0.25、0.5、1.25、2.5、3.75、5、7.5 mL于10 mL容量瓶中，用丙酮定容并摇匀。此系列标准工作溶液的浓度为0、0.44、0.88、2.2、4.4、6.6、8.8、13.2、17.6 mg/mL。

1.3.2 柑橘类挥发油样品溶液的制备

分别取不同橘皮各20 g，剪成1 cm×1 cm大小碎片，采用水蒸气蒸馏方法进行提取。根据文献[17]报道，在装有提取物的烧瓶中同时加入氯化铵，能够改变细胞内外渗透压，提高柠檬烯的提取率，实验时加入氯化铵0.7 g。通入水蒸气连续蒸馏提取2 h，然后把馏出液倒入分液漏斗中，加入1 mL饱和氯化钠溶液，每次用10 mL石油醚萃取3次。合并萃取液，加入适量的无水硫酸钠干燥30 min后，再减压过滤除去干燥剂。用旋转蒸发仪把石油醚完全蒸馏出去后，可以得到淡黄色具有柑橘香味的挥发油。称质量，用丙酮溶解，制成浓度为5 mg/mL的样品储备溶液备用。

1.4 气相色谱条件

色谱柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；氢火焰离子化检测器(flame inoization detector,FID)；检测器温度250 ℃。程序升温：起始温度70 ℃，保留16 min，以30 ℃/min升温至250 ℃，保留1 min。载气为氮气，流速1 mL/min；进样方式为分流，分流比100∶1；自动进样器进样量1 μL。

2 结果

2.1 气相色谱分离结果

按“1.4”项下的色谱条件，标准对照品柠檬烯和柑橘样品的色谱图见图1，柠檬烯的出峰时间为14.374 min。

图1 柠檬烯对照品和柑橘挥发油样品的气相色谱图

2.2 线性关系

把按照“1.3.1”项下配制成的柠檬烯丙酮系列标准工作溶液，采用“1.4”项下的色谱条件，以1 μL的进样量自动进样，进行气相色谱分析测定。以峰面积y为纵坐标，对照品柠檬烯的质量浓度x(mg/mL)为横坐标，其线性回归方程为：y=153.4x-1.223，相关系数r2=0.999 0，图2为峰面积与浓度关系图，这表明柠檬烯浓度在0～17.6 mg/mL范围内有良好的线性关系。

图2 柠檬烯丙酮溶液峰面积与浓度线性关系

2.3 精密度试验

按照“1.4”项下的色谱条件，采用自动进样器，取对照品柠檬烯溶液(4.4 mg/mL)以1 μL的进样量进样，测定气相色谱所得峰面积。日内连续进样6次，峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.65%；日间连续进样6 d，峰面积RSD为1.45%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

按“1.3.2”制备的样品溶液，密封4 ℃下放置，分别于0、1、2、3、4、5、6、7 h后，在设定的色谱条件下自动进样器进样，根据气相色谱所得峰面积的测定值，7 h内的RSD为1.26%，表明供试品溶液在7 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验

取同一批按“1.3.2”制备的供试样品挥发油6份，在设定的色谱条件下，以1 μL的进样量连续自动进样。6份供试样品挥发油中柠檬烯的浓度和RSD的计算结果详见表1，表明该方法的重复性良好。

表1 重复性试验结果

2.6 加样回收率试验

取按“1.3.2”制备的挥发油供试品样品9份，分为3组，每组分别平行3份。各组按照1∶0.8、1∶1、1∶1.2的比例加入已知量的对照品柠檬烯，在设定的色谱条件下自动进样器连续进样，根据峰面积的测定值，计算加样回收率和RSD值见表2，表明本方法的准确度良好。

表2 加样回收率实验结果

2.7 柑橘果皮挥发油柠檬烯的含量测定

取不同产地的柑橘皮，按照“1.3.2”分别制备样品溶液，按上述气相色谱条件测定并计算柠檬烯在提取挥发油中的质量百分含量，详见表3。

表3 柑橘果皮挥发油中柠檬烯的含量结果

3 讨论

柠檬烯一般有三种存在形式，分别是D-柠檬烯、L-柠檬烯和 DL-柠檬烯，在柑橘类果皮挥发油中主要以D-柠檬烯存在[1,18]。实验采用水蒸气蒸馏法可以有效地提取柑橘类果皮中的挥发油，本研究所建立的气相色谱测定方法，就是测定D-柠檬烯在挥发油中的含量。由于气相色谱实验所用溶剂都是易挥发的，根据多次试验的经验，在实验时待测溶液都应该密封冷藏保存，才能避免因溶剂的挥发而产生的影响，同时也提高了测定的准确度。从图1可知，实验所得到的色谱图中柠檬烯峰形对称，无杂质峰干扰，分离度好，所以本方法可用于挥发油中柠檬烯含量的定量测定。

根据本研究中14种柑橘果皮挥发油中柠檬烯的测定结果，可以看出柠檬烯在各种柑橘类果皮中的挥发油含量差异较大，含量最高的是从新鲜的砂糖橘皮提取到的，柠檬烯含量为89.63%，晒干后为84.44%，这表明砂糖橘皮晒干后柠檬烯的含量有所降低。另外，从本研究表3的结果中可以看出，我国南方产的砂糖橘、赣南脐橙、小叶桔、南丰蜜桔、沃柑、柠檬果皮的挥发油中都含有大量的柠檬烯。鉴于柠檬烯在食品[19]、农药[20]、医药等领域的应用价值[21-22]，也希望本研究所建立的方法能够为柑橘类果皮资源的合理利用以及柠檬烯的质控研究奠定基础。

致谢：本论文获得“基础与专业药学国家级实验教学示范中心(首都医科大学)”和“医学化学与药学北京高等学校示范性校内创新实践基地(首都医科大学)”两大平台的支持。