胃癌成纤维细胞中HAS2对胃癌细胞转移的影响

唐忠斌，苏彧，刘伟

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，是癌症相关死亡的第二大原因[1-2]。由于早期胃癌及癌前病变患者无明显症状，且缺乏准确有效的诊断性生物标志物，导致大多数胃癌患者就诊时皆为晚期[3-5]。胃癌晚期时，肿瘤细胞侵入血液或淋巴管，并转移到远处器官。此过程涉及多个步骤及因素，其中肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用是影响肿瘤转移的关键因素之一[6-7]。肿瘤微环境是一种复杂的组织环境，由细胞外基质和各种类型的基质细胞，如胃癌成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、巨噬细胞、炎症细胞和间充质干细胞等组成[8]。成纤维细胞是肿瘤的重要组成部分，通过分泌细胞因子、生长因子及趋化因子构成了诱导肿瘤生长、侵袭和转移的有利环境[9-10]。张子文[11]研究发现，透明质酸合成酶(hyaluronan synthases 2，HAS2)在舌癌相关成纤维细胞中高表达，可促进舌癌细胞的侵袭。HAS2是细胞膜整合蛋白，广泛分布于各组织，具有促进肿瘤细胞增殖、激活血管形成通路，促进肿瘤转移的功能[12-13]。在口腔癌中，HAS2在口腔癌组织及癌成纤维细胞中高表达，且HAS2的高表达与口腔癌的进展密切相关[14]。因此，本研究通过探究HAS2在胃癌组织CAFs中的表达，阐明CAFs中HAS2对胃癌侵袭、迁移及上皮-间质转化的影响，以期为临床胃癌进展的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本

选取2017年4月至2020年3月在我院进行胃癌切除手术的患者19例。所有患者术前未接受放化疗等治疗，病历资料完整。其中，男13例，女6例；年龄(46.00±4.27)岁；淋巴转移患者4例，无淋巴转移患者15例。手术获得的标本保存于-80 ℃。本研究上报我院伦理委员会申报批准(伦理批号：2017-0024)，患者及其家属对本研究知情并签字知情同意书。

1.2 细胞株及主要试剂

胃癌细胞SGC7901购自中国科学院上海细胞生物学研究所。HAS2、α-SMA、vimentin、E-cadherin与N-cadherin抗体购自美国CST公司。si-NC与si-HAS2由Genepharma公司合成。Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司。改良Eagle培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)、RPMI-1640培养基、胎牛血清及胰酶购自广州鼎国生物技术有限公司。

1.3 细胞培养及转染

收集胃癌组织及癌旁正常组织，剪下 5 mm×5 mm的组织块，根据组织块贴壁培养法培养原代细胞，差异消化法去除上皮细胞后，保留正常成纤维细胞(normal tibroblasts,NFs)与胃癌相关CAFs细胞，利用含15%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2的条件下于培养箱中培养。胃癌细胞SGC7901用含有15%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃、5%CO2的条件下于培养箱中培养。收集对数生长期的胃癌相关CAFs，依据Lipofectamine 3000转染试剂说明书将si-NC与si-HAS2转染胃癌相关CAFs，分别设置为si-NC组与si-HAS2组，6 h后更换培养基。

1.4 CAFs条件培养基的收集

收集各组对数生长期的CAFs细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，收集20 mL细胞在培养瓶内培养，当细胞生长融合至90%时，收集CAFs细胞，离心去除细胞碎片，收集上清，获得各组CAFs条件培养基。

1.5 Western blot检测HAS2、α-SMA、vimentin、E-cadherin与N-cadherin蛋白表达

提取NFs及各组CAFs条件培养基孵育24 h后的胃癌细胞SGC7901总蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法检测总蛋白浓度，调整总蛋白浓度为4 μg/μL，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳后，转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭1 h，磷酸盐吐温缓冲液(Phosphate buffer solution tween, PBST)洗膜，加入 HAS2、α-SMA、vimentin、E-cadherin与N-cadherin抗体，4 ℃摇床孵育过夜，PBST洗膜。加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记山羊抗兔二抗(1∶1 000)，37 ℃孵1 h，PBST 洗膜。显影曝光，通过Image-Pro Plus图像分析系统对蛋白条带的灰度值进行分析。

1.6 免疫荧光染色检测HAS2、α-SMA、vimentin、E-cadherin的表达

将NFs、各组CAFs细胞在含4%多聚甲醛的培养基中固定30 min，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗涤。滴加0.2% TritonX-100 在37 ℃下孵育15 min，PBS洗涤。加入5%山羊血清封闭0.5 h，滴加一抗HAS2、α-SMA、vimentin及E-cadherin在4 ℃下孵育过夜。滴加TRITC标记山羊抗兔IgG为二抗，37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗涤。避光加入4′,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(4′,6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色 10 min，荧光防猝灭剂密封，在荧光显微镜下观察并拍摄免疫荧光图像。

1.7 Transwell检测胃癌细胞侵袭能力

离心收集对数生长期的胃癌细胞SGC7901，利用各组CAFs细胞条件培养基重悬胃癌细胞SGC7901，调整SGC7901细胞浓度，在上室接种5×104个SGC7901细胞，下室加入无血清的DMEM培养基，培养24 h后，4%多聚甲醛固定细胞30 min，棉签基质胶，结晶紫染色15 min，PBS洗涤后，显微镜下计数。

1.8 划痕闭合实验检测胃癌细胞迁移能力

将胃癌细胞SGC7901接种于6孔板内，15%胎牛血清的DMEM培养基培养，当细胞融合至达90%时，无菌枪头在细胞单层上轻划。PBS轻轻洗涤细胞，去除脱落细胞及细胞碎片。将各组CAFs条件培养基加入含有胃癌细胞的6孔板内，培养24 h。显微镜下观察并测量胃癌细胞的伤口闭合度。通过image J系统检测细胞迁移面积。划痕闭合率(%)=(0 h时划痕面积-24 h时划痕面积)/0 h时划痕面积×100%。

1.6 统计学分析

2 实验结果

2.1 胃癌组织中CAFs的表型鉴定

Western blot实验结果(图1A)显示，α-SMA在CAFs细胞中高表达，在NFs中低表达，vimentin在CAFs与NFs中均表达，而上皮标志物E-cadherin在CAFs与NFs中均不表达。免疫荧光染色实验结果(图1B、C、D)显示，α-SMA在CAFs细胞高表达，且vimentin在CAFs与NFs中均表达，E-cadherin在CAFs与NFs中均不表达。

图1 胃癌组织中CAFs的表型鉴定 A: Western blot检测α-SMAz、vimentin、E-cadherin在CAFs和NFs中的表达, *P<0.05, vs CAFs; B: 免疫荧光染色检测α-SMAz在CAFs和NFs中的表达(×200); C: 免疫荧光染色检测vimentin在CAFs和NFs中的表达(×200); D: 免疫荧光染色检测E-cadherin在CAFs和NFs中的表达(×200)

2.2 HAS2在CAFs与NFs中的表达

Western blot(图2A)与免疫荧光染色实验(图2B)结果显示，HAS2在CAFs中高表达，在NFs中低表达。

图2 HAS2在CAFs和NFs中的表达 A:Western blot检测， *P<0.05, vs NFs; B:免疫荧光染色检测

2.3 沉默HAS2对CAFs促进胃癌细胞侵袭影响

Western blot实验结果(图3A)显示，与si-NC组相比，si-HAS2组CAFs中HAS2蛋白表达显著降低(P<0.05)，免疫荧光染色实验结果(图3B)显示，与si-NC组相比，si-HAS2组CAFs中HAS2表达降低。Transwell实验结果(图3C)显示，与si-NC组相比，si-HAS2组胃癌细胞侵袭细胞数降低(P<0.05)。

图3 沉默HAS2对CAFs促进胃癌细胞侵袭影响 A:Western blot检测沉默HAS2对CAFs中HAS2表达的影响, *P<0.05, vs si-NC;B:免疫荧光染色(Bar=100 μm)检测沉默HAS2对CAFs中HAS2表达的影响;C: Transwell检测沉默HAS2对CAFs促进胃癌细胞侵袭的影响, *P<0.05, vs si-NC

2.4 沉默HAS2对CAFs促进胃癌细胞迁移的影响

划痕闭合实验结果(图4A)显示，与si-NC组相比，si-HAS2组胃癌细胞划痕闭合率降低(P<0.05)。

图4 沉默HAS2对CAFs促进胃癌细胞迁移的影响 通过划痕闭合试验检测沉默HAS2对CAFs促进胃癌细胞迁移的影响, *P<0.05, vs si-NC

2.5 沉默HAS2对CAFs促进胃癌细胞上皮-间质转化的影响

Western blot实验结果(图5A)显示，与si-NC组相比，si-HAS2组胃癌细胞中E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，Vimentin与N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。

图5 沉默HAS2对CAFs促进胃癌细胞上皮-间质转化的影响 Western blot检测沉默HAS2对CAFs促进胃癌细胞上皮-间充质转化相关蛋白表达的影响, *P<0.05, vs si-NC

3 讨论

胃癌转移是一个多步骤过程，最终癌细胞扩散到肿瘤起源以外的组织和器官，并形成新的肿瘤病灶，致使患者的预后较差，死亡率居高不下[15-16]。肿瘤间质中的CAFs是肿瘤获得侵袭和转移等恶性行为的重要细胞。CAFs是异质活化的成纤维细胞，其形态为纺锤形，细胞核细长，较未激活的成纤维细胞略厚[17]。研究显示，根据发现的位置不同，CAFs可分为：p-CAFs(原发肿瘤的CAFs)、c-CAFs(血液循环中发现的CAFs)和m-CAFs(转移部位的CAFs)，而且每种CAFs细胞在诱导癌细胞转移和侵袭方面都具有不同程度的作用[18-19]。与NFs相比，CAFs高表达基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、单羧酸转运蛋白4(monocarboxylate transporters 4，MCT4)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、白细胞介素-22(interleukin-22，IL-22)、透明质酸合酶2(recombinant hyaluronan synthase 2，HAS2)等，诱导细胞外间质(extracellular matrix，ECM)沉积、促进血管生成和上皮-间质转化、调节代谢重编程、增强增殖和化疗耐药等[20]。Wang等[21]研究显示，乳腺癌CAFs通过自噬促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化；Naito等[22]研究显示，间质成纤维细胞的活化与胃癌细胞的高转移性相关，胃癌细胞外囊泡通过诱导趋化因子，活化CAFs，致使其异质性的形成，而且CAFs中趋化因子CXC型趋化因子配体1(CXC chemokine ligand 1，CXCL1)和趋化因子CXC型趋化因子配体8(CXC chemokine ligand 8，CXCL8)的异常激活与胃癌患者的生存相关，说明CAFs在调控胃癌发生发展中扮演重要角色。近年研究报道已证明，CAFs可作为癌症治疗的潜在治疗靶点[23-24]。因此，探究CAFs促进胃癌进展及转移机制，对临床诊断及治疗胃癌具有一定的参考价值。

本研究成功分离培养CAFs与NFs细胞，vimentin在CAFs与NFs中均表达，且上皮标志物E-cadherin在CAFs与NFs中不表达，说明CAFs与NFs细胞都是间质细胞，具有纤维细胞特征，细胞纯度高。α-SMA是肌纤维母细胞标志，也是间质细胞活化的标志。研究显示，NFs与肿瘤细胞共培养，可自发高表达α-SMA，获得CAFs表型特征[25]。本研究结果显示，α-SMA在所分离培养的CAFs中高表达，说明分离培养的CAFs是由肿瘤刺激而处于活化状态的成纤维细胞。HAS2是位于质膜上的一种关键酶，利用胞质底物udp-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和udp-n-乙酰氨基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)，将正在生长的聚合物通过膜挤压形成伸长的透明质酸分子，透明质酸通过与细胞表面的蛋白质结合或分泌到细胞外基质中，进而促进肿瘤的发生发展[26]。研究显示，HAS2是癌相关成纤维细胞调控的主要酶之一，可诱导肿瘤细胞上皮-间质转化[8]。本研究发现，HAS2在胃癌CAFs中高表达，提示HAS2可能与CAFs促进胃癌发生发展相关。Zhang等人[14]研究结果显示，HAS2在口腔癌组织中高表达，可能参与口腔癌的淋巴转移。通过连续切片发现HAS2定位于肿瘤相关成纤维细胞，敲减HAS2抑制了口腔癌成纤维细胞对肿瘤细胞侵袭的促进作用。本研究通过siRNA下调胃癌相关成纤维细胞中HAS2的表达，发现胃癌细胞的侵袭及迁移能力降低，而且降低了胃癌细胞上皮-间质转化相关蛋白的表达，说明沉默胃癌CAFs中的HAS2，可以抑制胃癌细胞侵袭、迁移及上皮-间质转化。

综上所述，HAS2在胃癌成纤维细胞中高表达，下调胃癌CAFs中HAS2的表达可抑制胃癌细胞侵袭、迁移及上皮-间质转化。HAS2是透明质酸(haluronic acid、HA)合成所需关键酶，在乳腺癌研究中，HA的合成及表达与肿瘤进展相关。因此，胃癌成纤维细胞中HAS2对胃癌细胞进展的影响是否与透明质酸有关，需进一步研究与探讨。本研究在体外细胞水平上进行，提示下调CAFs中HAS2表达可能是阻碍胃癌进展的一个策略，对深入研究肿瘤微环境中CAFs的作用机制奠定了理论基础。