南非叶中总黄酮提取工艺的优化

雷燕妮，张小斌，陈书存，陈冬平，李多伟

(1.商洛学院，陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西 商洛 726000；2.商洛市中医医院，陕西 商洛 726000；3.西安宇沐生物技术研究院有限公司，陕西 西安 710001；4.西北大学 生命科学学院，陕西 西安 710069)

扁桃斑鸠菊的别名为南非叶，扁桃斑鸠菊(VernoniaamygdalinaDel.)是菊科斑鸠菊属的一种植物，其原产于热带非洲，最多见于西非。近年来从新加坡、马来西亚移植到中国，在台湾、广东、海南等地均有引种，其叶既可入药，也可作为蔬菜食用[1～3]。南非叶具有抗氧化、抗肿瘤等多种生理活性与其含有丰富的有效成分如生物碱、皂苷、黄酮类、萜类、类固醇、香豆素类、酚酸类、木酚素、蒽醌类、氧杂蒽酮和倍半萜等有密切相关受到医药科研工作者的亲睐[4,5]。黄酮类是南非叶中主要的一种成分，南非叶黄酮类成分对乳腺癌、肝癌、白血病、宫颈癌等疾病的治疗方面己经取得一定的成果，主要采用了多种靶向、多样化通道等方法。随着对南非叶药用价值研究的不断深人，南非叶在临床上的应用前景将越来越广阔。

南非叶总黄酮在药品、保健品中的应用已广泛展开，为使南非叶总黄酮在生产中得到充分的利用，我们拟以南非叶总黄酮的含量作为实验指标，采用单因素实验和正交实验，优化南非叶中总黄酮的提取工艺[6,7]，为生产企业开发利用南非叶奠定理论基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

南非叶购于大荔镰塬农业发展有限公司，李智选研究员(西北大学生命科学学院植物教研室)鉴定为菊科斑鸠菊属植物扁桃斑鸠菊(VernoniaamygdalinaDel.)。

1.2 试剂及药品

对照品芦丁购于成都德思特生物技术有限公司；NaOH、NCl、乙醇、甲醇、NaNO2、Al(NO3)3等化学试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器

HH.S21-4型数显电热恒温水浴锅(上海博讯)、RE201旋转蒸发器(郑州市申研仪器设备有限公司)、SHB-IIIA循环水式真空泵(林茂科技(北京)有限公司)、BSA224S-CW电子天平(深圳市林涛仪器有限公司),JIDI-6D台式低速大容量离心机(广州吉迪仪器有限公司)、i8双光束紫外可见分光光度计(济南海能仪器股份有限公司)；HA-300超声萃取器(北京恒奥德仪器仪表有限公司)、实验室小型真空干燥箱(上海和晟仪器科技有限公司)、XC-2500Y型高速万能粉碎机(永康市沃美户外用品有限公司)等。

2 实验及结果分析

2.1 南非叶中总黄酮含量的测定

采用紫外可见分光光度计法测定南非叶中总黄酮的含量[8]。

2.2 南非叶提取总黄酮的单因素实验

2.2.1 南非叶总黄酮提取方法及提取溶剂的选择 工艺设计：粉碎南非叶过3号筛，精密称取粗粉5 g，4份，按1∶12料液比分别加入55%乙醇溶液、75%乙醇溶液、95%乙醇溶液和水各60 mL于烧瓶中，热回流提取120 min，过滤，滤液定容，对溶液中总黄酮的含量进行测定，采用紫外可见分光光度计法，测定结果见表1。

另取过3号筛粉碎的南非叶，精密称取粗粉5 g，4份，按1∶12料液比分别加入55%乙醇溶液、75%乙醇溶液、95%乙醇溶液和水各60 mL于烧瓶中，超声(20kHz)提取60 min，过滤，滤液定容，对溶液中总黄酮的含量进行测定，采用紫外可见分光光度计法，测定结果见表1。

表1 不同提取方法、不同溶剂南非叶总黄酮的提取效果(n=3)

实验对南非叶中总黄酮提取率的影响进行研究，采用了不同提取方法、不同提取溶剂，结果发现在超声提取法中，提取能力为水<95%乙醇溶液<55%乙醇溶液<75%乙醇溶液，75%乙醇溶液提取能力明显优于55%乙醇溶液；在热回流提取法中，提取能力为水<95%乙醇溶液<55%乙醇溶液<75%乙醇溶液，75%乙醇溶液提取能力明显优于55%乙醇溶液；超声法对南非叶总黄酮的提取效果略优于热回流法对南非叶总黄酮的提取，在本实验中，笔者以75%乙醇溶剂作为提取溶剂。

2.2.2 总黄酮提取的单因素实验 取过3号筛粉碎的南非叶，精密称取粗粉5 g，4份，在不同的提取时间、不同的料液比和不同的提取次数下用75%乙醇溶液进行超声提取，过滤，滤液定容，对溶液中总黄酮的含量的测定，采用紫外可见分光光度计法，通过实验结果判断最佳的提取条件。

不同料液比对南非叶提取总黄酮的效果

取过3号筛粉碎的南非叶，精密称取粗粉5 g，4份，按料液比为1∶20、1∶16、1∶12、1∶8分别加入75%乙醇溶液各100 mL、80 mL、60 mL、40 mL，超声提取60 min，2次，过滤，滤液定容，溶液中总黄酮的含量的测定采用紫外可见分光光度法，测定结果见表2。

不同提取时间对南非叶提取总黄酮的效果

取过3号筛粉碎的南非叶，精密称取粗粉5 g，4份，按料液比1∶16加入75%乙醇溶液各80 mL，超声提取30 min、45 min、60 min、75 min，2次，过滤，滤液定容，溶液中总黄酮的含量的测定采用紫外可见分光光度法，测定结果见表2。

不同提取次数对南非叶提取总黄酮的效果

取过3号筛粉碎的南非叶，精密称取粗粉5g，4份，按料液比1:16加入75%乙醇溶液各80ml，超声提取60min，1次、2次、3次、4次，过滤，滤液定容，溶液中总黄酮的含量的测定采用紫外可见分光光度法，测定结果见表2。

表2 不同料液比、不同提取时间和不同提取次数对南非叶提取总黄酮含量的结果比较(n=3)

表2可以看出：在相同条件下，超声波提取随料液比的提高提取率在增加， 1∶16料液比后超过总黄酮的含量增加幅度变小，分析其原因是溶剂量的加大提高了溶液浓度差，利于物质的传质，1∶16料液比后总黄酮的溶出度基本上达到平衡，所以当料液比增加时，总黄酮的含量没有明显的增加，所以确定了采用超声提取时，料液比为1∶16；在相同条件下，当提取时间的延长时，超声波提取率也相应在增加，不过当超声60 min后，提取率却呈缓慢增加的趋势，分析其原因是超声波的空化作用可以在较短时间内达到较高的提取率，随后由于浓度差的降低提取率增加缓慢。由于超声提取时间的增加，会使生产成本提高，所以建议把超声提取的时间进行控制，不要超过60 min；在相同条件下，当提取次数增加时，超声波提取率也有所提高，可是当超声提取2次以后，提取率却呈缓慢增加的趋势，分析其原因是超声波的空化作用可以在较短时间内达到较高的提取率，随后由于物质基本被浸出，提取率增加缓慢。由于增加超声提取次数，会使生产成本大幅度提高，所以提取2次为最佳的超声提取次数。

2.3 南非叶提取总黄酮正交实验

以2.2南非叶提取总黄酮单因素实验不同的提取时间、不同的料液比和不同的提取次数下实验结果为参考，为探讨各工艺参数之间相互交叉的相互影响，用正交实验的四因素三水平来研究确定总黄酮超声提取的最佳工艺参数。

正交实验总黄酮超声提取正交表L9(34)及结果见表3，直观分析总黄酮超声提取得率结果见表4，方差分析总黄酮超声提取结果见表5。

表4 总黄酮超声提取得率直观分析结果

表5 总黄酮超声提取得率方差分析结果

按正交表L9(34)设计安排，取过3号筛粉碎的南非叶，精密称取粗粉5 g，9份，按料液比为1:8、1:12、1:16，分别加入55%乙醇溶液、75%乙醇溶液和95%乙醇溶液各40 mL、60 mL和80 mL，超声提取45 min、60 min、75 min，过滤，滤液定容，溶液中总黄酮的含量的测定采用紫外可见分光光度法，测定结果见表3。

表3 总黄酮超声提取正交表L9(34)及结果

通过正交试验表4直观分析、表5方差分析，影响实验效果的因素分别是超声波提取乙醇溶剂浓度、超声波提取料液比、超声波提取时间和超声波提取次数。按效益生产原则可确定最佳的提取条件为A2、B2、C2、 D2,即用浓度为75%的乙醇作为提取溶剂，按料液比1∶12超声波提取2次，每次60 min。

2.4 南非叶提取总黄酮验证实验

取过3号筛粉碎的南非叶，精密称取粗粉200 g，3份，按料液比1∶12，加入75%乙醇溶液各2 400 mL，超声提取60 min，2次，过滤，滤液再经过减压浓缩，成为膏样状态，真空干燥，溶液中总黄酮的含量的测定采用紫外可见分光光度法，测定结果见表6。

表6 南非叶提取总黄酮验证实验结果(n=3)

南非叶提取总黄酮验证实验结果表明，对南非叶总黄酮的提取，采用醇超声提取时，所得总黄酮含量提取率较高，操作简单，工艺稳定。

3 讨论

(1)超声波提取有助于有效成分的溶出与释放是由于空化作用对细胞膜的破坏以及超声波提取对提取液的不断振荡有助于溶质的扩散所致。本实验研究超声波提取60 min，提取2次可有效的提高南非叶总黄酮的提取率。

(2)本实验通过超声提取的单因素实验及正交实验对南非叶提取总黄酮进行工艺优化,确定出最佳提取工艺参数为：用料液比为1∶12的75%乙醇溶剂超声提取60min，提取2次。此工艺具有南非叶提取总黄酮操作简单、省溶剂、省时等优点。

(3)超声提取具有提取温度低、提取效率高、溶剂用量少、省时等诸多优点，尤其是在提取热敏性物质中作用明显，本实验为南非叶工业化超声提取总黄酮生产提供可借鉴的实验参数。