胰激肽原酶对血管损伤后再狭窄内膜增殖与凋亡的影响

白俐 张林 郭道保

【摘要】 目的：观察胰激肽原酶对血管损伤后兔血管形态及MMP-2、TIMP-2、P53蛋白表达的影响。方法：18只西新兰兔随机分为假手术组、模型组及胰激肽原酶组，每组6只。通过球囊损伤制备兔腹主动脉损伤模型，并进行3周的胰激肽原酶治疗，之后观察血管形态及检测MMP-2、TIMP-2、P53蛋白表达的变化。结果：与假手术组相比，模型组内膜增生明显（P<0.05）;与模型组相比，胰激肽原酶组内膜增生有改善（P<0.05）。模型组MMP-2、TIMP-2表达均较假手术组升高，胰激肽原酶组MMP-2表达较模型组下降，差异均有统计学意义（P<0.05）;胰激肽原酶组TIMP-2表达与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;模型组P53表达较假手术组下降，胰激肽原酶组P53表达较模型组升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：胰激肽原酶具有抑制血管损伤后内膜增生，与促进P53蛋白表达及抑制MMP-2表达相关。

【关键词】 胰激肽原酶 血管损伤 再狭窄 内膜增殖

Effects of Pancreatic Kininogenase on Intimal Proliferation and Apoptosis in Restenosis after Vascular Injury/BAI Li， ZHANG Lin， GUO Daobao. //Medical Innovation of China， 2021， 18（12）： 0-020

[Abstract] Objective： To observe the effect of Pancreatic Kininogenase on vascular morphology and MMP-2，

TIMP-2， P53 protein expression in rabbits after vascular injury. Method： A total of 18 rabbits were randomly divided into sham operation group， model group and Pancreatic Kininogenase group， 6 rabbits in each group. The abdominal aortic injury model was prepared by balloon injury and treated with Pancreatic Kiniogenase for 3 weeks. The blood vessel morphology and MMP-2， TIMP-2， P53 protein expression were observed. Result： Compared with the sham group， the intima hyperplasia in model group was obvious （P<0.05）， and compared with the model group， the intimal hyperplasia in the Pancreatic Kininogenase group was improved （P<0.05）. The MMP-2， TIMP-2 expression in the model group were higher than those in the sham operation group， the MMP-2 in the Pancreatic Kininogenase group was lower than that in the model group， and the differences were statistically significant （P<0.05）， and the TIMP-2 expression showed no difference between the Pancreatic Kininogenase group and the model group （P>0.05）. And the P53 expression in the model group was lower than that in the sham operation group， the P53 expression in the Pancreatic Kininogenase group was higher than that in the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Pancreatic Kininogenase can inhibit intimal hyperplasia after vascular injury， related to promoting P53 protein expression and inhibiting MMP-2 expression.

[Key words] Pancreatic Kininogenase Vascular injury Restenosis Intimal proliferation

First-authors address： Guangzhou Xinhai Hospital， Guangzhou 510000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.12.004

随着技术发展，经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）目前成为治疗冠心病常规療法，但其术后3～6个月再狭窄（RS）发生率高，即使使用药物洗脱支架后再狭窄率仍达6.4%[1]。故如何防治PTCA术后再狭窄成为大家探索的热点话题。其中基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂（TIMPs）、凋亡相关因子P53、bcl-2/bax等证实均参与PTCA术后再狭窄发生，而近年研究发现胰激肽原酶有调控凋亡蛋白、抗纤维化、氧化应激等作用，从而对高心病心肌重构、肾脏纤维化等产生影响[2-4]。本研究旨在通过胰激肽原酶对兔腹主动脉球囊损伤术后血管形态观察及MMPs、TIMPs、P53检测而探讨其对血管再狭窄影响，为PTCA术后再狭窄防治提供新的思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验从2019年5月开始人员培训和试剂、动物准备等前期工作，至2020年11月完成动物实验、各指标检测及数据收集。新西兰兔，雄性，18只，体重2.5～3.5 kg，平均（2.87±0.51）kg，单笼、恒温、恒湿度饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2017-0125。

1.2 药物与试剂 注射用胰激肽原酶（生产厂家：常州千红生化制药股份有限公司，批准文号：国药准字H20023177，规格：40单位），注射用青霉素钠（生产厂家：西南药业股份有限公司，批准文号：国药准字H50020196，规格：80万单位），肝素钠注射液（生产厂家：天津生物化学制药有限公司，批准文号：国药准字H12020505，规格：

2 mL︰12 500单位），戊巴比妥钠盐（生产厂家：广州鼎国生物技术有限公司，生产批号：66810240，规格：25 g/瓶）。

1.3 仪器与器材 3.5 mm×23 mm PTCA球囊扩张导管[生产厂家：上海微创医疗器械（集团）有限公司，批准文号：国食药监械（准）字2013第3771104号]、生物组织自动脱水机（生产厂家：泰维科技，型号：TC-120C）、生物组织全自动染色机（生产厂家：泰维科技，型号：TR-180）、生物组织自动包埋机（生产厂家：泰维科技，型号：TB-718L）、生物组织自动包埋机（生产厂家：泰维科技，型号：TB-718D）、轮转式切片机（生产厂家：徕卡显微系统有限公司，型号：RM2235）、恒温摊片烤片机（生产厂家：泰维科技，型号：TK-218）、显微镜（生产厂家：厦门麦克奥迪，型号：AE2000）、离心机（生产厂家：德国SIGMA，型号：3K15）。

1.4 方法

1.4.1 血管球囊损伤模型建立 术前12 h禁食，4 h禁水。将3%戊巴比妥钠盐（将3 g戊巴比妥钠盐溶于100 mL双蒸水配制获得）1 mL/kg经耳缘静脉注射麻醉兔，仰卧位固定，无菌条件暴露和分离右股动脉，同时于耳缘静脉注射肝素钠注射液100 U/kg，结扎右股动脉后做一楔形缺口，将3.5 mm×23 mm球囊送入20 cm至腹主动脉膈下处，用压力泵以

15个大气压充盈球囊，回抽球囊至有阻力，到达股动脉处，释放球囊内压力，再重复送入球囊、扩张，如此反复抽拉3次， 30 s/次，间隔1 min。假手术组除不插入球囊导管外，其余步骤同上。术后3 d肌内注射注射用青霉素钠80万单位预防感染。

1.4.2 分组及给药 将上述手术新西兰兔分为三组，每组6只，分别为假手术组、模型组、胰激肽原酶组。假手术组兔不予插入球囊导管损伤腹主动脉，其余两组行建立血管球囊损伤模型。注射用胰激肽原酶溶于生理盐水后肌注给药。假手术组与模型组给予同体积生理盐水肌注，胰激肽原酶组给予注射用胰激肽原酶14.4 U/（kg·d）（1 mL/kg）肌注，于术前1周开始给药，术后再连续给药2周。兔每周称体重一次。

1.4.3 标本收集 末次给药后处死兔，先麻醉，然后原位腹主动脉灌注含5 000 U/L肝素的生理盐水20 min，压力100 mm Hg，接着用10%甲醛灌注30 min，压力100 mm Hg，然后分离腹主动脉，剪取每只兔相同部位长约1.5 cm的受损伤腹主动脉血管段，用冰冻生理盐水清洗血管段，并剪下其中一段置于4%的多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片、HE染色，其余血管段匀浆后3 000 r/min离心10 min取上清，采用ELISA测定血管中P53、MMP-2、TIMP-2蛋白含量。

1.4.4 切片观察及处理 切片采用显微镜进行拍照，然后用Image-Pro Plus 6.0的图像分析软件对切片照片进行图像分析。首先对图像进行编辑，分别勾选出管腔、内弹力膜、外弹力膜的轮廓，然后用工具测出管腔的面积、内弹力膜包含的面积、外弹力膜包含的面积，然后通过公式计算：内膜面积（I）=内弹力膜包含的面积-管腔面积，中膜面积（M）=外弹力膜包含面积-内弹力膜包含的面积，并且以I/M来表示球囊损伤后兔腹主动脉内膜增生的程度。每组兔的每张切片进行5次测量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰激肽原酶对兔体重的影响 假手术组、模型组、胰激肽原酶组兔各时间点体重比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 胰激肽原酶对兔腹主动脉I、M、I/M影响 与假手术组比较，模型组管腔明显狭窄，内皮下新生内膜增厚，其内细胞较正常平滑肌细胞小，形态不规则，排列紊乱。细胞核多数呈椭圆或圆形，少数呈梭形，胞核大小不一。与模型组相比，胰激肽原酶组血管内膜增生程度显著减轻，新生内膜纤维结缔组织及平滑肌细胞均减少，细胞多呈梭形。见图1～3。与假手术组比较，模型组、胰激肽原酶组I、M、I/M均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，胰激肽原酶组I、I/M均降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表2。

2.3 胰激肽原酶对兔血管中MMP-2、TIMP-2、P53蛋白含量的影响 模型组MMP-2、TIMP-2表达均较假手术组升高，胰激肽原酶组MMP-2表达较模型组下降，差异均有统计学意义（P<0.01），TIMP-2表达与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）;模型组P53表达较假手术组下降，胰激肽原酶组P53表达较模型组升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表3。

3 讨论

胰激肽原酶是一组存在于人体中的丝氨酸蛋白酶，是生物体内激肽释放酶-激肽系统重要组分，使激肽原释放激肽而发挥作用。激肽具有多种生物学效应，包括改善循环、舒张血管等[5]，故其多用于改善微循环障碍。有研究发现，其还有具有促进血管新生、抑制氧化应激、炎性反应、调控血压等作用，而在改善梗死后侧支循环、输尿管梗阻大鼠肾脏纤维化、高血压大鼠心肌重构等方面发挥作用，其机制与胰激肽原酶可调控凋亡蛋白、增加NO表达、抑制MMP-2等相关[2-6]。

PTCA术后再狭窄是一种血管损伤的修复反应，由多种细胞因子和生长因子参与介导，主要机制包括内膜损伤后血小板聚集、炎症反应、血管平滑肌细胞（VSMC）过度增殖和迁移等[7]。内膜增厚和血管重构是再狭窄的两大主要因素[8]。而VSMC增殖、迁移和合成大量细胞外基质（ECM）在其起到关键性作用[9]。基质金属蛋白酶（MMPs）及其组织抑制剂（TIMPs）在此过程中发挥重要作用[10]。MMPs是一种离子依赖性的蛋白酶家族，可由多种细胞产生[11]。MMP-2、MMP-9作为最主要的明胶酶，通过降解VSMC基底膜基质，导致血管VSMC表型发生改变，使之由中膜向内膜迁移并增生，并分泌大量ECM，从而促进内膜增生、血管重构，最终导致 RS的发生[12]。在生物体内，TIMPs为MMPs的主要抑制因子。正常情况下MMP、TIMPs以1︰1的分子比例非共价结合，而其表达不平衡与RS发生紧密相关[13]。Koike等[14]研究证实TIMP-2通过抑制膜型基质金属蛋白酶-1和MMP2从而抑制血管RS形成。本研究中通过ELISA法测定MMP-2、TIMP-2含量，在假手术组中，仍含有少量MMP-2、TIMP-2，且两者比例相近。与假手术组相比，模型组MMP-2、TIMP-2明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05），且两者升高程度不协同，MMP-2升高更明显，考虑此时期MMP-2在VSMC增殖、迁移过程中发挥重要作用，模型组内膜增生明显。与周晓莉等[15]实验结果相同。胰激肽原酶组与模型组相比，内膜增生程度显著改善，MMP-2水平降低，差异均有统计学意义（P<0.05），对TIMP-2水平无明显影响，考虑胰激肽原酶通过降低MMP-2水平，减少VSMC增殖、迁移，改善内膜增生。

已有研究表明，在PTCA术后内膜增生过程中细胞凋亡始终参与其中[16-17]。其与细胞增殖相伴随，两者的抗衡决定内膜厚度及细胞数量[18]。血管损伤后，细胞增殖率大于细胞凋亡率致再狭窄发生。血管在球囊损伤后，在血管活性因子和生长因子等多种因素作用下抑癌基因活性受抑制，激活原癌基因，细胞增殖信号启动，而凋亡不足，导致再狭窄发生。其中P53是研究较多的抑癌基因，其在血管损伤后促细胞凋亡，抑制RS发挥重要作用[19]。p53基因编码细胞周期调节的关键蛋白， 通过激活p21发挥抑制cyclins的活性。其编码的蛋白质可以抑制细胞从G0期进入G1和S期，从而抑制细胞的增殖[20]。在本次研究中发现，血管损伤后P53蛋白表达较正常血管减少，考虑在血管受损后抑癌基因表达减少，促进细胞增殖，致内膜增生。予胰激肽原酶处理后，P53蛋白表达增加，血管内膜增殖受到抑制，考虑胰激肽原酶通过促进P53蛋白表达，促进细胞凋亡，抑制血管RS发生。

胰激肽原酶通过降低MMP-2水平、促进P53蛋白表示，而抑制内膜增生及血管重塑发生，抑制血管损伤后再狭窄。本研究为临床预防血管成形术后再狭窄提供新的思路，而其过程有无对炎性因子（如白介素）及细胞因子（如NO）影响而发挥预防RS作用，可予后续研究。

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（收稿日期：2021-02-04） （本文编辑：程旭然）