单手性半导体碳纳米管在生物成像中的研究进展

许文静，侯军才，赵建文

1.陕西理工大学材料科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所印刷电子研究中心，江苏 苏州 215123

半导体碳纳米管(SWCNT)的卓越性能归功于独特的sp2碳蜂窝结构，其极佳的电学、光学、机械性能和生物兼容性，使半导体碳纳米管成为未来计算机芯片、印刷薄膜晶体管器件和电路、抗辐照电子器件、单光子光源和探测器、能源器件和生物成像等领域最理想的半导体材料之一，相关研究已成为当今科技前沿热点[1,2]。如半导体碳纳米管在近红外二区(NIR-Ⅱ，1.0～1.4 μm)中的光致发光为生物的荧光成像提供了理想探针[3]。但是，多种手性随机分布的碳纳米管带隙不唯一，在光致发光时会导致荧光猝灭，这很大程度上限制了碳纳米管在生物成像上的应用[4]，而单手性碳纳米管具有唯一的带隙，在激发源下可以在近红外二区表现出强共振激发，有利于生物体内的荧光成像，并使超低剂量的碳纳米管在体内应用成为可能。但目前无法直接生长和制备单手性碳纳米管。商业化的碳纳米管主要采用电弧放电[5]、激光烧蚀[6,7]、化学气相沉积法[8,9]和催化裂解法[10]等制备而成，这些碳纳米管中往往包含有多种手性的碳纳米管。随着碳纳米管分离技术的发展，人们采用凝胶色谱法[11]、密度梯度超速离心[12,13]、两相萃取法[14]和聚合物分离[15]等方法可以将少量的单手性半导体型碳纳米管从中分离出来。下面从单手性半导体碳纳米管分离和生物成像两方面进行介绍。

1 单手性碳纳米管的分离方法

目前，通过各种方法制备出的碳纳米管都是由金属型碳纳米管、半导体型碳纳米管、无定形碳和催化剂等杂质组成的混合物。虽然可以通过现有的分离技术将半导体型碳纳米管从商业化碳纳米管粉末中分离出来，但是分离出来的半导体碳纳米管是多种手性的碳纳米管混合物，如何大量、低成本地获取单手性碳纳米管一直是一个挑战。以下是目前常用分离单手性碳纳米管的技术：

(1)凝胶色谱法。利用一种表面活性剂和一系列垂直连接的凝胶柱，对碳纳米管进行大规模手性分离。该方法基于碳纳米管与烯丙基葡聚糖的凝胶结构相互作用强度[9]。在顶部色谱柱上，过多的碳纳米管分散液会导致色谱柱的吸附位被碳纳米管完全占据，未结合的碳纳米管流到下一色谱柱中。与凝胶相互作用较强的碳纳米管被逐一固定，而其他未固定的碳纳米管流到下一色谱柱中，也将被逐一固定在相应的色谱柱中。

(2)密度梯度超速离心法。受生化分离方法的启发，美国西北大学Hersam小组首先展示了密度梯度超速离心法半导体碳纳米管选择性分离,这是碳纳米管分离领域的一项重大突破[13]。其原理是通过高速离心实现不同密度的碳纳米管分层，进而实现单手性的分离。由于密度梯度超速离心法的高选择性和迭代性质，已实现了99%以上的半导体纯度和88%以上的单手性碳纳米管富集。但该法需要多步离心，存在设备成本高、操作时间长等缺点，在一定程度上限制了其应用。

(3)两相水相萃取法。2013年，Khripin等[14]首先报道了用两相萃取法(ATPE)对碳纳米管进行分离。将聚乙二醇和右旋糖酐混合形成两个不混溶相，由于碳纳米管的管径、长度和手性等不同，碳纳米管在聚乙二醇相和富葡聚糖相之间进行选择性分配，实现分离。

(4)聚合物分选法。2007年，Nish等[15]证明芴基聚合物对半导体型碳纳米管显示出优越的包裹能力，且这种方法非常简单，仅需要两步：首先，将原始碳纳米管粉末与聚合物混合在有机溶液中进行超声处理，随后，将超声处理后的溶液进行高速离心，提取富含半导体碳纳米管的上清液。

2 单手性碳纳米管的生物医学应用

分离纯化的半导体碳纳米管已开始应用于生物医学领域。半导体碳纳米管在近红外生物窗口中显示出固有的荧光和强大的光学吸收性能，使其成为生物体内成像和光热疗法的理想材料。对于生物医学成像，由于生物系统不能吸收近红外光，因此对可以在近红外条件下发光的荧光物质的需求量越来越大。更重要的是，生物组织发出的光的强度与光的波长有关，即光的波长越长，散射越小，光能可更深入地穿透组织[16,17]。因此，碳纳米管是一种适合于在体内深处成像的半导体材料。

碳纳米管的一维性质使它们在对应于范霍夫奇点的Eii处具有吸收和发射特性，并且可以通过调整碳纳米管的手性来进一步调节Eii跃迁的能量[18]。2012年，Diao等[16]对比了HiPCO样品与富含手性(12,1)&(11,3)的紫外-可见-近红外吸收光谱图，如图1(a)所示，这两个手性的S11峰与S22峰的位置都很接近，由图1(b)可以明显看出(12,1)&(11,3)碳纳米管所发出的荧光更加明亮，富含手性(12,1)&(11,3)的荧光光谱强度是HiPCO样品的5倍。将200 μL浓度为0.016 mg/mL的(12,1)&(11,3)碳纳米管溶注入裸鼠体内，观测(12,1)&(11,3)碳纳米管在裸鼠体内随时间变化的荧光成像效果，如图1(c)所示。从图1可知，(12,1)&(11,3)碳纳米管的剂量只需达到HiPCO样品1/6的注射剂量时就可以实现良好的生物学成像。考虑到(12,1)&(11,3)碳纳米管的纯度仍然不高，并且这两种碳纳米管不能以完全相同的波长发光，该团队使用密度梯度高速离心法分离出单手性(6,5)碳纳米管，进一步优化，提高生物成像性能，后续研究将其用于双重成像和光热治疗[17]。如图2所示，与手性分布随机的未分离的HiPCO相比，单手性碳纳米管的纯度随迭代次数的增加而增加，通过二次迭代富集的(6,5)碳纳米管在荧光光谱中的亮度是它们的6倍左右;给裸鼠注射二次迭代后的高纯度单手性(6,5)碳纳米管后，碳纳米管在肿瘤区域产生了明显的聚集现象。并且，采用980 nm激光照射碳纳米管溶液，富集(6,5)的样品比未分类的样品温度升高幅度更大，这归因于共振吸收高效地加热了(6,5)碳纳米管，从而使肿瘤成像更加清晰，并达到了所需的光热肿瘤消融温度。在基于纳米材料体内治疗剂中碳纳米管非常低剂量时也能实现清晰成像。此外，Antaris等[19]还通过在密度梯度高速离心法分离过程中调节pH值获得超高纯度单手性(6,4)碳纳米管(>99%纯度)，并用于近红外生物成像。单手性(6,4)碳纳米管的独特之处在于S22(873 nm)能量为1.42 eV，可使价格低廉的硅探测器代替昂贵的InGaAs探测器，大幅降低成本，使之在临床应用中更加实用。

图1 HiPCO碳纳米管与(12,1)&(11,3)碳纳米管的(a)紫外-可见-近红外吸收光谱图和(b)NIR-II的荧光图像；(c)裸鼠注入200 μL浓度为0.016 mg/mL的(12,1)&(11,3)碳纳米管溶液随时间变化的荧光图像(上图)和裸鼠的PCA图像(下图)，其中肺部为绿色，肾脏为粉红色，肝脏为蓝色[16]

图2 (a) 从左到右分别为HiPCO碳纳米管，第一次迭代获得的(6,5)碳纳米管和第二次迭代获得的(6,5)碳纳米管的光学和荧光图像；(b) 4T1肿瘤裸鼠注射PBS的近红外荧光图像；(c) 4T1肿瘤裸鼠注射HiPCO碳纳米管溶液的近红外荧光图像；(d) 在右肩上带有4T1肿瘤的小鼠的光学图像；(e)～(g) 为注射(6,5)碳纳米管溶液后6 h、24 h和 48 h的近红外荧光图像[17]

2016年，Yomogida等[20]利用凝胶色谱法分离出单手性(9,4)碳纳米管，(9,4)碳纳米管的发射和激发波长位置很有利于生物成像，其S11峰(1101 nm)是水、皮肤和黏液的低吸收区，S22(724 nm)是含氧血红蛋白的低吸收区[21]。如图3所示，使用分离的(9,4)碳纳米管作为荧光探针进行了小鼠脉管系统的近红外荧光成像。由于每单位质量的吸收和发射强度高，经表面活性剂交换的生物相容性(9,4)碳纳米管的荧光强度是原始HiPCO碳纳米管的20倍，可清晰显示出血管和深部内脏，具有较高的信号强度。

图3 (a) 注射34 μg的(9,4)碳纳米管(左图)和128 μg的HiPCO 碳纳米管的裸鼠的荧光图像(右图)；(b) 注射剂量不同的(9,4)碳纳米管(1.7～0.17 μg每只小鼠)与未注射的裸鼠的荧光图像对照(上图)，并调节至最佳对比度后的荧光图像(下图)[20]

研究表明，即使在没有靶向剂的情况下，被注射到裸鼠体内的碳纳米管也会在裸鼠接种的肿瘤中积累[16,22]，恶性肿瘤的特点是大量繁殖并发生转移。目前，癌症的治疗方法是手术、化疗和放射疗法去除病变的整个肿块，但是，由于癌细胞通过淋巴和血液系统扩散，因此很难通过手术完全去除转移性病变[23]。因此，为了了解癌症的转移路径，除了检测原发肿瘤外，还必须可视化癌细胞的转移。曾有研究发现通过氧掺杂化学修饰可以改变碳纳米管的激发与吸收波长[24]，2019年，Sekiyama等[25]使用紫外灯照射(6,5)碳纳米管，对(6,5)碳纳米管形成氧掺杂，使(6,5)碳纳米管发射峰位置红移至1280 nm，探究通过掺杂调控后的碳纳米管是否可以标记癌细胞转移，将氧掺杂的碳纳米管用PEG(聚乙二醇)处理后使其具有更好的生物兼容性(O-SWCNT-PEG)。如图4(a)所示，将肿瘤Colon-26细胞置于富含O-SWCNT-PEG的培养基中，每两天更换一次含有O-SWCNT-PEG的培养基，发现荧光强度会随着时间推移逐渐增加。图4(b)作为对照组，第一天和第二天将肿瘤Colon-26细胞置于富含O-SWCNT-PEG的培养基中，第三天开始更换不含O-SWCNT-PEG的培养基，注意到直到第5天，细胞中O-SWCNT-PEG才开始出现荧光图像，表明荧光强度随时间和O-SWCNT-PEG浓度增加而增加。

图4 第1、3、5和7天在980 nm激光激发下，带有Colon-26细胞的O-SWCNT-PEG的近红外二区荧光图像(a) 将Colon-26细胞放在浓度为1.6 μg/ mL的O-SWCNT-PEG培养基中，每48 h更换一次含有O-SWCNT-PEG培养基； (b) 作为对照组，在第0～2天用浓度为1.6 μg/mL的O-SWCNT-PEG培养基后，更换不含O-SWCNT-PEG的培养基(绿色表示O-SWCNT-PEG的近红外二区荧光图像)[25]

如上所述，通过化学掺杂对单手性碳纳米管的发射和吸收峰进行调控使之红移，近红外二区单手性碳纳米管对光的散射非常弱，从而提供更好的穿透深度，并减少对自发荧光的干扰。大管径半导体碳纳米管能够在更长的波长(如>1400 nm)下进行生物成像，这使得对大直径的单手性半导体碳纳米管的需求越来越迫切[26]。如何分离纯化管径更大的半导体碳纳米管并研究其在生物成像等领域中的应用,已成为碳基电子里的一大研究热点。

3 展望

要真正实现单手性半导体型碳纳米管的应用，首先需要在单手性半导体碳纳米管可控生长和合成纯化等方面进行深入研究，同时需进一步开发以实现大量高纯度的单手性半导体型碳纳米管富集技术。尽管目前在实现这些目标方面取得了重大进展，但生长和富集的方法主要集中在小管径的单手性碳纳米管上，最具代表性的材料是(6,5)碳纳米管。因此，应重点致力于能普遍应用的不同管径的单手性碳纳米管生长与富集的研究，特别是管径>1 nm的单手性半导体碳纳米管。单手性半导体碳纳米管的独特特性使其不仅能够荧光成像标记肿瘤，同时还有望用于治疗，目前虽还在实验阶段，但已经在生物医学上展现出了巨大的潜力。除在生物医学中，单手性半导体碳纳米管也在计算机芯片、能源电池、单光子发射器与单光子探测器等方面有着潜在的优势和发展前景。